Question

【題目】雞干擾素是一種具有高效和廣譜抗病毒作用的細胞因子，廣泛用于動物領域的抗病毒治療�？蒲腥藛T將雞干擾素基因作為目的基因，構建基因表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法導入煙草，以獲得抗病毒煙草。下圖為科研人員制備能合成雞干擾素的煙草愈傷組織細胞的流程，①～④表示相關的操作，兩種限制酶的識別序列及切割位點如表所示。請回答下列問題：

(1)步驟①中，利用PCR技術擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據(jù)是_________�？蒲腥藛T還在兩種引物的一端分別加上了________和________序列，以便于后續(xù)的剪切和連接。為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，構建表達載體需用兩種限制酶，選擇的原則是：Ti質(zhì)粒內(nèi)，每種限制酶有________個切割位點，酶切后，目的基因形成的兩個黏性末端序列_______(相同/不相同)

(2)步驟②所構建的基因表達載體中未標注出的必需元件還有________，步驟③中需先用________處理農(nóng)桿菌以便將基因表達載體導入細胞。

(3)步驟④中，科研人員提取愈傷組織細胞的RNA后，先通過________獲得DNA，再進行PCR擴增，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是________________。

Answer 1

【答案】 雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC 1 不相同 復制原點 Ca2+ 逆轉錄 雞干擾素基因未能導入煙草愈傷組織細胞或?qū)�入煙草愈傷組織細胞的雞干擾素基因未能轉錄 或雞干擾素的mRNA 已經(jīng)被水解

【解析】試題分析：本題考查基因工程，考查對目的基因獲取、基因表達載體構建等基因工程步驟的理解，解答此題，可根據(jù)圖中切割目的基因和質(zhì)粒時所用的限制酶判斷目的基因兩端應添加的堿基序列，根據(jù)基因表達的環(huán)節(jié)分析愈傷組織細胞中不能檢測出干擾素基因的原因。

(1)利用PCR技術擴增雞干擾素基因時，引物應可以和雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列進行堿基互補配對，根據(jù)雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列可設計引物的堿基序列。據(jù)圖可知，該轉基因過程用EcoRⅠ和BamHⅠ兩種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，以避免質(zhì)�；蚰康幕�因的自身連接，應在兩種引物的一端分別加上EcoRⅠ和BamHⅠ的識別序列GAATTC和GGATCC，以便于后續(xù)的剪切和連接。Ti質(zhì)粒中每種限制酶有1個切割位點，則酶切產(chǎn)物兩端粘性末端不同，不會發(fā)生自身環(huán)化。

(2)基因表達載體中除含有啟動子、終止子、標記基因和目的基因外，還應含有復制原點，以便在宿主細胞中復制。將基因表達載體導入農(nóng)桿菌，可用Ca2+處理農(nóng)桿菌，以增大細胞壁通透性，提高轉化效率。

(3提取愈傷組織細胞的RNA后，可通過逆轉錄獲得DNA。雞干擾素基因即便導入了農(nóng)桿菌，也不一定能導入煙草愈傷組織細胞，導入煙草愈傷組織細胞的雞干擾素基因不一定能夠正常轉錄，轉錄出的雞干擾素的mRNA 若被水解，則不能通過逆轉錄獲得雞干擾素基因，以上原因均可能導致愈傷組織細胞中不能檢測出雞干擾素基因。