Question

【題目】穿梭載體是一類具有兩種不同復(fù)制原點(diǎn)、能在兩種不同的生物體（物種不同）中復(fù)制的載體，一般在原核生物和真核細(xì)胞中都能復(fù)制和表達(dá)，如Ti質(zhì)粒和哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒pMT2。回答下列問題。

（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體前，需先獲取目的基因。PCR技術(shù)可用于目的基因的擴(kuò)增，其原理是 ________。用PCR技術(shù)從基因文庫(kù)中獲取并擴(kuò)增目的基因，需要加入人工合成的___做為引物；PCR反應(yīng)體系中需加入的原料是____。

（2）若要構(gòu)建一個(gè)穿梭質(zhì)粒，使其能夠在大腸桿菌中大量復(fù)制，且能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，質(zhì)粒上除啟動(dòng)子、終止子、多個(gè)限制酶酶切位點(diǎn)和標(biāo)記基因外，還需要有____的復(fù)制原點(diǎn)。

（3）下圖為某種哺乳動(dòng)物穿梭質(zhì)粒示意圖，現(xiàn)欲使用該質(zhì)粒表達(dá)人生長(zhǎng)激素，但人生長(zhǎng)激素基因所在的DNA片段上不含圖中限制酶識(shí)別序列。為使PCR擴(kuò)增的人生長(zhǎng)激素基因定向插入該質(zhì)粒，擴(kuò)增的人生長(zhǎng)激素基因兩端設(shè)計(jì)的序列應(yīng)含有____（填下圖中的限制酶名稱）的切割位點(diǎn)。

（4）將該穿梭質(zhì)粒、目的基因混合后形成的重組質(zhì)粒與感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞混合，完成轉(zhuǎn)化過程，再?gòu)呐囵B(yǎng)的大腸桿菌細(xì)胞中提取質(zhì)粒，可獲得大量該質(zhì)粒。在含卡那霉素的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞中____（填“一定”或“不一定”）含有目的基因，原因是____。

Answer 1

【答案】DNA雙鏈復(fù)制 一小段單鏈DNA 4 種脫氧核苷酸 大腸桿菌和哺乳動(dòng)物 NdeⅠ和BamHⅠ 不一定 若大腸桿菌細(xì)胞中導(dǎo)入的是未攜帶目的基因的（穿梭）質(zhì)粒，大腸桿菌細(xì)胞也能在含卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)

【解析】

1、PCR技術(shù)：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。

（1）原理：DNA復(fù)制；

（2）前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一對(duì)引物；

（3）條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；

（4）過程：①高溫變性：DNA解旋過程（PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開）；低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。

2、基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）PCR技術(shù)是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。其原理是DNA雙鏈復(fù)制。在PCR反應(yīng)體系中，需加入一小段已知核苷酸序列的DNA單鏈，以便合成引物；需加入四種脫氧核苷酸作為合成DNA的原料。擴(kuò)增過程是在較高溫度下進(jìn)行的，因此需要加入耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）。

（2）基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因等。穿梭載體具有兩種不同復(fù)制原點(diǎn)，構(gòu)建一個(gè)能夠在大腸桿菌中大量復(fù)制，且能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的穿梭質(zhì)粒，需要加入大腸桿菌和哺乳動(dòng)物的復(fù)制原點(diǎn)。

（3）如果在哺乳動(dòng)物的穿梭質(zhì)粒中插入人生長(zhǎng)激素基因，基因表達(dá)載體中目的基因的上游為啟動(dòng)子，下游為終止子。圖示啟動(dòng)子和終止子之間的限制酶有NdeI、XbaI、BamHI三種，其中XbaI有兩個(gè)酶切位點(diǎn)，一個(gè)位點(diǎn)在終止子下游，所以為使PCR擴(kuò)增的人生長(zhǎng)激素基因定向插入該質(zhì)粒，擴(kuò)增的人生長(zhǎng)激素基因兩端設(shè)計(jì)的序列應(yīng)含有NdeⅠ和BamHⅠ的切割位點(diǎn)。

（4）穿梭質(zhì)粒、目的基因混合后，導(dǎo)入到大腸桿菌細(xì)胞的有可能是沒有攜帶目的基因的穿梭質(zhì)粒，其上含有卡那霉素抗性基因，在含有卡拉霉素的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)，所以在含卡那霉素的培養(yǎng)基中能夠生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞中不一定含有目的基因。