Question

【題目】引起人類產(chǎn)生埃博拉出血熱的埃博拉病毒（EBOV），是一種單鏈RNA病毒，某研究團隊利用其跨膜表面糖蛋白（GP），以重組腺病毒為載體研發(fā)了埃博拉疫苗。腺病毒是一種DNA病毒，腺病毒載體包括骨架質(zhì)粒（攜帶腺病毒的主要功能基因）和穿梭質(zhì)粒（能轉(zhuǎn)移外源基因到骨架質(zhì)粒上）。下圖為重組埃博拉疫苗制作的部分流程示意圖，已知四種限制性核酸內(nèi)切酶KpnI、BamHI、NheI、BgIII的識別序列和酶切位點分別為：。請回答下列問題：

（1）為了判斷是否感染EBOV，利用探針對疑似患者進行核酸檢測，其檢測方法采用了______技術(shù)。為了提高檢測的準確性，需從EBOV核酸中選取具有______的序列作為探針設(shè)計的模板。

（2）從EBOV基因組中分離出的GP基因不能直接與穿梭質(zhì)粒重組，其原因是______；而過程①獲得的GP基因片段因兩端缺乏______也不能直接與穿梭質(zhì)粒重組。研究人員在過程①獲得的GP基因片段下游添加了含“-AGATCT-”的序列，則需在其上游添加包含有______序列的片段，以便與穿梭質(zhì)粒重組，且能避免GP基因反向連接。

（3）實際操作中需利用限制酶將環(huán)狀的重組穿梭質(zhì)粒切成兩個核苷酸片段，則切割前后含有的游離磷酸基團數(shù)目變化為______。將含GP基因的核苷酸片段與骨架質(zhì)粒通過過程④完成重組，再在含______的平板上培養(yǎng)，篩選出含重組骨架質(zhì)粒的陽性菌。

（4）過程⑤中，利用脂質(zhì)體將重組骨架質(zhì)粒導(dǎo)入到人的胚胎腎細胞HEK293中，其運用的原理是______，再將成功導(dǎo)入的細胞HK293培養(yǎng)一段時間，獲得大量重組腺病毒，為疫苗的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

Answer 1

【答案】分子雜交 特異性 GP基因是單鏈RNA結(jié)構(gòu) 相應(yīng)的限制酶酶切位點（或相應(yīng)的限制酶識別序列） -GGTACC- 0→4 卡那霉素 膜的流動性

【解析】

基因工程是狹義的遺傳工程，基因工程的基本原理是讓人們感興趣的基因（即目的基因）在宿主細胞中穩(wěn)定高效地表達。為了實現(xiàn)基因工程的目標，通常要有多種工具酶、目的基因、載體和宿主細胞等基本要素，并按照一定的程序進行操作，它包括目的基因的獲得、重組DNA的形成，重組DNA導(dǎo)入受體細胞也稱（宿主）細胞、篩選含有目的基因的受體細胞和目的基因的表達等幾個方面�；�因表達載體的構(gòu)建（即目的基因與運載體結(jié)合）是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。

（1）為了判斷是否感染EBOV，利用探針（能與病毒的互補配對的序列）對疑似患者進行核酸檢測，其檢測方法采用了分子雜交技術(shù)（堿基互補配對）。為了提高檢測的準確性，需從EBOV核酸中選取具有特異性的序列作為探針設(shè)計的模板。

（2）EBOV是RNA病毒，從EBOV基因組中分離出的GP基因是單鏈RNA結(jié)構(gòu)，不能直接與穿梭質(zhì)粒重組，且過程①獲得的GP基因片段因兩端缺乏相應(yīng)的限制酶酶切位點（或相應(yīng)的限制酶識別序列）也不能直接與穿梭質(zhì)粒重組。質(zhì)粒與目的基因相連，需要有相同的粘性末端，因此需要在目的基因兩端添加酶切位點，從圖中可知質(zhì)粒的啟動子和終止子之間有三種酶切位點（KpnI、BamHI、BgIII），“-AGATCT-”的序列是BgIII的識別位點，若用BamHI來酶切，會得到相同的粘性末端，因此只能用KpnI來酶切質(zhì)粒，則需在GP基因上游添加包含有-GGTACC-序列的片段，且能避免GP基因反向連接。

（3）實際操作中需利用限制酶將環(huán)狀的重組穿梭質(zhì)粒切成兩個核苷酸片段，有兩個酶切位點，一個酶切位點會比切割前多出來2個游離的磷酸基團，則切割前后含有的游離磷酸基團數(shù)目變化為0→4。將含GP基因的核苷酸片段與骨架質(zhì)粒通過過程④完成重組，重組質(zhì)粒含卡那霉素抗性基因，因此需在含卡那霉素的平板上培養(yǎng)，篩選出含重組骨架質(zhì)粒的陽性菌。

（4）脂質(zhì)體(空心)是由卵磷脂和神經(jīng)酰胺等制得的雙分子層結(jié)構(gòu)，過程⑤中，利用脂質(zhì)體將重組骨架質(zhì)粒導(dǎo)入到人的胚胎腎細胞HEK293中，其運用的原理是膜的流動性（相似相溶）。