Question

【題目】回答下列（一）、（二）小題

（一）研究小組從土壤中分離胞外脲酶高產(chǎn)菌株的過程如下：

（1）尿素固體培養(yǎng)基的配制：將葡萄糖、NaCI、K2HPO4、酚紅、水和凝固劑___________按配方配置好_________，加入三角瓶并用封口膜封口后用__________法滅菌。待冷卻至60℃時(shí)，加入經(jīng)____處理的尿素溶液，搖動(dòng)，混勻后倒平板。

（2）從___________環(huán)境中采集土樣，用無菌水等梯度稀釋，接種到平板。培養(yǎng)皿在37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24h后，用接種環(huán)挑選___________的菌落，接種到液體培養(yǎng)基中，并震蕩培養(yǎng)48h。

（3）將培養(yǎng)液離心，取___________測(cè)定脲酶活性。得到的脲酶可用圖___________法固定化以利于連續(xù)使用。

（二）擬利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將北極海魚的抗凍基因轉(zhuǎn)入番茄，以提高番茄的抗凍能力，請(qǐng)回答：

（1）將含抗凍基因的DNA和農(nóng)桿菌的___________用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶切割，形成___________，再用DNA連接酶連接獲得重組質(zhì)粒。

（2）將重組質(zhì)粒與經(jīng)___________處理的農(nóng)桿菌在離心管中混合，在離心管中加入液體培養(yǎng)基，置于___________中慢速培養(yǎng)一段時(shí)間，使農(nóng)桿菌恢復(fù)正常狀態(tài)。選用的農(nóng)桿菌應(yīng)是限制性核酸內(nèi)切酶缺陷型菌株，原因是_________________________________。

（3）用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得含抗凍基因的番茄細(xì)胞后，經(jīng)脫分化形成愈傷組織，再通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的___________誘導(dǎo)再生出新植株。

（4）請(qǐng)簡(jiǎn)要描述個(gè)體水平檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番茄是否成功表達(dá)的實(shí)驗(yàn)思路：______________________。

Answer 1

【答案】瓊脂糖 調(diào)節(jié)pH 高壓蒸汽滅菌 G6玻璃砂漏斗/過濾滅菌 有哺乳動(dòng)物排泄物的 紅色環(huán)帶直徑與菌落直徑的比值較大 上清液 交聯(lián)法 Ti質(zhì)粒 相同粘性末端 CaCl2 搖床 防止限制性核酸內(nèi)切酶將目的基因剪切 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（植物激素）配比 將轉(zhuǎn)基因番茄和正常番茄置于低溫環(huán)境下，比較轉(zhuǎn)基因番茄是否具有抗凍性狀

【解析】

（一）細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑培養(yǎng)細(xì)菌，若指示劑變紅，可確定該種細(xì)菌能夠產(chǎn)生脲酶，并分解尿素。

（二）基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。
（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。
（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（一）（1）瓊脂糖可作為固體培養(yǎng)基中的凝固劑。對(duì)培養(yǎng)基應(yīng)先調(diào)節(jié)pH，后高壓蒸汽滅菌法滅菌。待冷卻至60℃時(shí)，加入經(jīng)G6玻璃砂漏斗/過濾滅菌處理的尿素溶液，搖動(dòng)，混勻后倒平板。

（2）脲酶將尿素分解成氨，哺乳動(dòng)物排泄物中含有尿素，因此從土壤中分離胞外脲酶高產(chǎn)菌株時(shí)，應(yīng)從有哺乳動(dòng)物排泄物的環(huán)境中采集土樣，用無菌水等梯度稀釋，接種到平板。脲酶將尿素分解成氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，加入酚紅指示劑，指示劑會(huì)變紅。因此用接種環(huán)挑選紅色環(huán)帶直徑與菌落直徑的比值較大的菌落。

（3）脲酶是細(xì)胞分泌物，離心后在上清液中。因此將培養(yǎng)液離心，取上清液測(cè)定脲酶活性。圖示為交聯(lián)法固定酶。

（二）（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理：農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。根據(jù)農(nóng)桿菌的這一特點(diǎn)，如果將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以把目的基因整合到植物細(xì)胞中染色體的DNA上。構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，首先將含抗凍基因的DNA和農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶切割，形成相同黏性末端，再用DNA連接酶連接獲得重組質(zhì)粒。
（2）將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞常采用感受態(tài)細(xì)胞法，將重組質(zhì)粒與經(jīng)CaCl2處理的農(nóng)桿菌在離心管中混合，在離心管中加入液體培養(yǎng)基，置于搖床中慢速培養(yǎng)一段時(shí)間，使農(nóng)桿菌恢復(fù)正常狀態(tài)。選用的農(nóng)桿菌應(yīng)是限制性核酸內(nèi)切酶缺陷型菌株，防止限制性核酸內(nèi)切酶將目的基因剪切。
（3）用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得含抗凍基因的番茄細(xì)胞后，經(jīng)脫分化形成愈傷組織，再通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（植物激素）配比誘導(dǎo)再生出新植株。
（4）從個(gè)體水平檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番茄是否成功表達(dá)的實(shí)驗(yàn)思路：將轉(zhuǎn)基因番茄和正常番茄置于低溫環(huán)境下，比較轉(zhuǎn)基因番茄是否具有抗凍性狀。