Question

【題目】如圖所示為A、B、C三種質(zhì)粒和一個含目的基因D的DNA片段示意圖。圖1中Ap為氨芐青霉素抗性基因，Tc為四環(huán)素抗性基因，lacZ為藍(lán)色顯色基因。圖中EcoRⅠ、PvuⅠ為兩種限制酶，質(zhì)粒上限制酶括號內(nèi)的數(shù)字表示限制酶切割位點與復(fù)制原點的距離�；卮鹣铝袉栴}：

（1）圖中三種質(zhì)粒中不能作為目的基因運載體的是______，理由是______、______。

（2）在基因工程的操作過程中，需要檢查目的基因是否重組到質(zhì)粒中，應(yīng)使用______酶切重組質(zhì)粒，完全酶切后，進(jìn)行電泳檢測。若電泳圖譜中出現(xiàn)長度為1.1kb和5.6kb，或者______kb和______kb的片段，則可判斷該重組質(zhì)粒已與目的基因重組成功。

（3）為研究目的基因D的功能，研究人員用圖2所示的引物組合分別擴增D基因的D1片段、D3片段（DNA復(fù)制子鏈的延伸方向5′→3′）。

注：引物Ⅱ、Ⅲ上的x、y片段分別與N基因兩端互補配對

①用引物Ⅰ、Ⅱ組合擴增后，得到的絕大部分DNA片段是圖3中的______。

②將大量N基因片段與擴增得到的D1片段、D3片段置于PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴增，得到的絕大多數(shù)擴增產(chǎn)物是______（填“D1-N”或“D1-D3-N”或“D3-N”或“D1-N-D3”）。

Answer 1

【答案】質(zhì)粒A、質(zhì)粒C（質(zhì)粒A）缺少標(biāo)記基因（質(zhì)粒C）復(fù)制原點會被限制酶切割EcoRⅠ3.13.6dD1-N-D3

【解析】

本題以圖文結(jié)合為情境綜合考查學(xué)生對基因工程的基本操作程序，特別是利用PCR技術(shù)擴增目的基因以及基因表達(dá)載體的構(gòu)建等相關(guān)知識的識記和理解能力，以及分析問題的能力。

(1)分析圖1可知：目的基因D的兩端均存在限制酶PvuⅠ的識別位點，而EcoRⅠ的識別位點則在目的基因D的內(nèi)部，因此在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，應(yīng)選用PvuⅠ切割含有目的基因D的DNA片段，以保證目的基因D的結(jié)構(gòu)完整。據(jù)此分析A、B、C三種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)可知：質(zhì)粒A缺少標(biāo)記基因，質(zhì)粒C在用和目的基因相同的限制酶PvuⅠ切割時，復(fù)制原點會被限制酶切割，進(jìn)而影響重組質(zhì)粒的自主復(fù)制，所以質(zhì)粒A、質(zhì)粒C均不能作為目的基因的運載體。

(2)依題意和分析圖1可知：由于目的基因D的長度為4.0kb，因此用質(zhì)粒B構(gòu)建的重組質(zhì)粒的長度為4.0kb＋2.7kb＝6.7kb。在檢查目的基因是否重組到質(zhì)粒中的操作過程中，重組質(zhì)粒被某種限制酶完全酶切后，電泳檢測的結(jié)果出現(xiàn)了1.1kb的片段，說明使用的限制酶不可能是PvuⅠ（用PvuⅠ切割不能得到1.1kb的片段），而是EcoRⅠ。用質(zhì)粒B構(gòu)建重組質(zhì)粒時，若目的基因D正向插入（目的基因D上的EcoRⅠ酶切位點與質(zhì)粒B上的EcoRⅠ酶切位點的距離最近），則用EcoRⅠ酶切時，會得到0.1＋1.0＝1.1（kb）和（2.7－0.1）＋（4.0－1.0）＝5.6（kb）的兩個片段；用質(zhì)粒B構(gòu)建重組質(zhì)粒時，若目的基因D反向插入（目的基因D上的EcoRⅠ酶切位點與質(zhì)粒B上的EcoRⅠ酶切位點的距離較遠(yuǎn)），則用EcoRⅠ酶切時，會得到0.1＋3.0＝3.1（kb）和（2.7－0.1）＋（4.0－3.0）＝3.6（kb）的兩個片段。

(3) 分析圖2可知：①用引物Ⅰ、Ⅱ組合擴增的是D1片段，以引物Ⅱ所在的單鏈為模板在引物Ⅰ的作用下合成DNA時，引物Ⅱ上的x片段也被作為模板合成子鏈，因此得到的絕大部分DNA片段是圖3中的d。②由于引物Ⅱ、Ⅲ上的x、y片段都能與N基因兩條鏈上的堿基進(jìn)行互補配對，因此將大量N基因片段與擴增得到的D1片段、D3片段置于PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴增，得到的絕大多數(shù)擴增產(chǎn)物是D1-N-D3。