Question

【題目】癌細胞表面蛋白“PDL﹣1”與T細胞表面蛋白“PD﹣1”特異性結(jié)合后，可抑制T細胞活性并啟動其凋亡，導(dǎo)致腫瘤細胞發(fā)生免疫“逃逸”。研究者對“PD﹣1”基因進行克隆、表達及生物學(xué)活性鑒定，為制備抗體打基礎(chǔ)。研究中所用引物α和β堿基序列見圖1、幾種常用限制酶名稱及識別序列與酶切位點見圖2：

（1）首先提取細胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄生成_____作為模板：設(shè)計含有不同的限制酶切點的α和β序列為引物，通過_____技術(shù)擴增目的基因。

（2）選用圖1中的兩種名稱分別為_____的限制酶將“pIRES2﹣EGFP質(zhì)粒”載體進行雙切，再用DNA連接酶將其與目的基因拼接，構(gòu)建表達載體。該表達載體的組成，除了目的基因、標記基因抗卡那霉素基因外，還必須具有_____等

（3）而后一定溫度下，與經(jīng)過Ca2+處理的感受態(tài)大腸桿菌混合培養(yǎng)在含有_____培養(yǎng)基中，可篩選出已經(jīng)完成轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，繼續(xù)培養(yǎng)該種大腸桿菌以擴增重組DNA。

（4）將擴增后的“pIRES2﹣EGFP載體/PD﹣1重組DNA”轉(zhuǎn)入可高度表達外源基因的原代293T細胞。一段時間后，為確定PD﹣1基因是否表達，檢測細胞膜表面是否具有_____。為判斷其是否具有生物學(xué)活性和功能，則可裂解293T細胞，提取該物質(zhì)看能否與_____發(fā)生結(jié)合，從而阻斷“PD﹣1與PDL﹣1信號通路”。研究中還會有一步驟，只將“pIRES2﹣EGFP載體”轉(zhuǎn)入293T細胞，其目的是_____。

Answer 1

【答案】cDNA PCR XhoI、EoRI 啟動子、終止子、復(fù)制原點 卡那霉素 PD﹣1蛋白 PDL﹣1或答ⅣD﹣1抗體 作為對照

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。
（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。
（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄形成cDNA；擴增目的基因可采用PCR技術(shù)。
（2）根據(jù)圖1中堿基序列和圖2中四種限制酶的識別序列可知，選用圖1中的兩種名稱分別為XhoI、EoRI的限制酶將“pIRES2EGFP質(zhì)粒”載體進行雙切，再用DNA連接酶將其與目的基因拼接，構(gòu)建表達載體�；�因表達載體的組成包括目的基因、標記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點等。
（3）根據(jù)第（2）題可知，標記基因是卡那霉素抗性基因，因此培養(yǎng)基中需要加入卡那霉素。
（4）將擴增后的“pIRES2EGFP載體/PD1重組DNA”轉(zhuǎn)入可高度表達外源基因的原代293T細胞。一段時間后，為確定PD1基因是否表達，檢測細胞膜表面是否具有PD1蛋白。為判斷其是否具有生物學(xué)活性和功能，則可裂解293T細胞，提取該物質(zhì)看能否與PDL1發(fā)生結(jié)合，從而阻斷“PD1與PDL1信號通路”。研究中還會有一步驟，只將“pIRES2EGFP載體”轉(zhuǎn)入293T細胞，其目的是作為對照。