Question

【題目】口蹄疫是口蹄疫病毒引起的一種動物性傳染病，目前常用接種弱毒疫苗的方法預(yù)防。疫苗的主要成分是病毒的一種結(jié)構(gòu)蛋白VP1�？茖W(xué)家嘗試利用轉(zhuǎn)基因番茄生產(chǎn)口蹄疫疫苗。請回答下列問題：

⑴Ti質(zhì)粒是農(nóng)桿菌中的一種質(zhì)粒，把目的基因插入Ti質(zhì)粒的___________中，可實現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)入受體細胞。

⑵構(gòu)建含VP1基因的重組Ti質(zhì)粒，還需要在質(zhì)粒上插入_________，便于目的基因的表達。

⑶口蹄疫病毒的遺傳物質(zhì)為RNA，則獲得能夠重組到質(zhì)粒上的VP1基因必須用到___________酶。如要獲得大量的該VP1基因，可利用________技術(shù)進行擴增，擴增產(chǎn)物可以與___________（填試劑名）在沸水浴條件下呈藍色。

⑷通常用BamH I、Hind III 兩種酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，獲得不同黏性末端構(gòu)建表達載體的原因是（寫出一條即可）_____________________________________；用含__________的培養(yǎng)基能篩選出含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。

⑸VP1基因轉(zhuǎn)入普通番茄細胞內(nèi)并成功實現(xiàn)表達的過程，在基因工程中稱為______。我們可以使用____________技術(shù)檢測目的基因是否插入了受體細胞的染色體DNA上。

Answer 1

【答案】T—DNA 啟動子 反轉(zhuǎn)錄（或“逆轉(zhuǎn)錄”） PCR 二苯胺（試劑） 防止VP1基因自身環(huán)化 或 防止Ti質(zhì)粒自身環(huán)化 或 防止目的基因（VP1基因）與質(zhì)粒反向連接 卡那霉素和四環(huán)素 轉(zhuǎn)化 DNA分子雜交

【解析】

1、基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）VP1基因應(yīng)插入 Ti質(zhì)粒上的T—DNA上，通過轉(zhuǎn)化作用進入番茄細胞并插入染色體DNA，使VP1基因能夠維持穩(wěn)定并發(fā)揮作用。

（2）基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因，為便于目的基因的表達，應(yīng)在質(zhì)粒上插入啟動子，啟動子是RNA聚合酶的結(jié)合位點，能啟動轉(zhuǎn)錄。

（3）口蹄疫病毒的遺傳物質(zhì)為RNA，要獲得目的基因，應(yīng)利用逆轉(zhuǎn)錄的方法，需要逆轉(zhuǎn)錄酶；PCR技術(shù)可在體外大量擴增目的基因；擴增的產(chǎn)物為DNA，與二苯胺（試劑）在沸水浴條件下呈藍色。

（4）只用一種酶切割目的基因和質(zhì)粒，得到的黏性末端都相同，VP1基因和Ti質(zhì)粒可能會自身環(huán)化，目的基因（VP1基因）與質(zhì)粒也可能反向連接，為避免出現(xiàn)這樣的情況，可用BamH I、Hind III 兩種酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，由圖可知，重組Ti質(zhì)粒中卡那霉素抗性基因完整，四環(huán)素抗性基因被破壞，所以用含卡那霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基能篩選出含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。

（5）將目的基因?qū)�入受體細胞，并使其在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為轉(zhuǎn)化；檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因使用的DNA分子雜交技術(shù)。