Question

【題目】白細(xì)胞介素-1（IL-1）是重要的炎性介質(zhì)之一，也是一種熱原質(zhì)成分，具有致熱和介導(dǎo)炎癥的作用。它主要在細(xì)胞免疫激活中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。某項(xiàng)目小組利用基因工程技術(shù)大量合成IL-1，在pBV220載體（圖A）多克隆位點(diǎn)的EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)之間插入目的基因IL1-His，構(gòu)建表達(dá)載體pBV-IL1-His（圖B）。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（大腸桿菌），通過選擇性培養(yǎng)基（Ampr）和菌體PCR法篩選重組子陽性克隆。在適宜條件下培養(yǎng)并誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，最后利用His抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測表達(dá)情況。

（1）在上述實(shí)驗(yàn)中，為了防止目的基因和pBV220載體在酶切后的末端發(fā)生任意連接，酶切時(shí)應(yīng)選用的酶是______________________。目的基因的長度為______pb（重組質(zhì)粒上目的基因的插入位點(diǎn)與酶切位點(diǎn)之間的堿基對忽略不計(jì)）。pBV-IL1-His表達(dá)載體除了氨芐青霉素抗性基因（Ampr）、目的基因外還必須具有______________________等基因。

（2）轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌時(shí)需要用________處理細(xì)胞。利用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增DNA時(shí)，需將雙鏈DNA加熱到90℃以上，目的是___________________________。

（3）最后是通過________________技術(shù)來檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)是否成功。假設(shè)未檢測出目的蛋白，分析可能的原因有______________________________。（寫出一種即可）

Answer 1

【答案】 EcoRⅠ和BamHⅠ 487 啟動子、終止子 Ca2+ 使雙鏈DNA變性，解聚為單鏈 抗原—抗體雜交 目的基因在受體細(xì)胞中沒有表達(dá)

【解析】試題分析：據(jù)圖可知酶切時(shí)應(yīng)選用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ，形成不同的黏性末端，這樣可以防止目的基因和pBV220載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，用Ca2+處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，據(jù)此答題。

（1）酶切時(shí)應(yīng)選用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ，形成不同的黏性末端，這樣可以防止目的基因和pBV220載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接。原來載體長度為3666pb，重組后為4153pb，所以目的基因長度為487pb�；�因表達(dá)載體構(gòu)建的目的是使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。因此一個(gè)基因表達(dá)載體的組成應(yīng)該包括啟動子、終止子、標(biāo)記基因及目的基因等。

（2）用Ca2+處理細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。利用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增DNA時(shí)，需將雙鏈DNA加熱到90℃以上，目的是使雙鏈DNA變性，解聚為單鏈。

（3）最后利用His抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測即抗原—抗體雜交技術(shù)。假設(shè)未檢測出目的蛋白，分析可能的原因有目的基因沒有與pBV220載體重組成功、目的基因在受體細(xì)胞中沒有表達(dá)等。