Question

【題目】研究發(fā)現(xiàn)，肆虐全球的新型冠狀病毒（2019-nCoV）為有包膜病毒，基因組為單股正鏈RNA，長度為29．8Kb。基于其特異性的基因組序列，科研工作者研制的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒（RT-PCR熒光探針法）為新型冠狀病毒感染的肺炎疫情防控提供了快速、簡便、精準的核酸檢測方案。RT-PCR熒光探針法即實時熒光定量PCR技術(shù)（Real Time Quantitative PCR），通過熒光標記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，通過儀器和相應(yīng)的軟件分析結(jié)果，對待測樣品通過檢測熒光信號的累積（以Ct值表示）來確定樣本中是否有病毒核酸。新型冠狀病毒檢測的具體操作過程如下圖。根據(jù)所學(xué)知識，請回答下列相關(guān)問題：

（1）新型冠狀病毒（2019-nCoV）的相關(guān)蛋白能在宿主細胞中正常表達的理論基礎(chǔ)是________________________________。

（2）該反應(yīng)體系中，過程①需要用到___________酶，在該體系中使用TaqDNA聚合酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是_______________________。

（3）過程③使反應(yīng)體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是___________，其作用是破壞了DNA雙鏈分子中的___，引物Ａ、Ｂ的作用是_____________。

（4）采集新冠肺炎疑似患者的咽部細胞樣本提取核酸進行上述ＲＴ－PCR過程，每一個擴增出來的DNA序列，都可與預(yù)先加入的一段熒光標記探針結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號，擴增出來的目的基因越多，觀察到的Ct值就越_________。

（5）RNA病毒分兩類，一類以自身RNA為模板直接進行RNA的復(fù)制；另一類以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成DNA，再以DNA為模板合成RNA，即逆轉(zhuǎn)錄病毒。請利用同位素標記法設(shè)計實驗證明新型冠狀病毒是否是逆轉(zhuǎn)錄病毒________________。（現(xiàn)有放射性同位素標記的胸腺嘧啶脫氧核苷酸及其他必要試劑，請簡要寫出實驗思路）

Answer 1

【答案】生物的遺傳物質(zhì)都是核酸，具有相似的組成成分和結(jié)構(gòu)；遺傳信息的傳遞都遵循中心法則（都遵循堿基互補配對原則）；所有生物共用一套密碼子 （2）逆轉(zhuǎn)錄酶 Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活 加熱至90～95 ℃ 氫鍵 定位目的基因的位置，與模板鏈結(jié)合并為子鏈的延伸提供起點 大 實驗思路：設(shè)法將新型冠狀病毒破碎，獲取其提取液，置于試管中，向試管中加入適量的放射性同位素標記的胸腺嘧啶脫氧核苷酸、逆轉(zhuǎn)錄酶、ATP等原料，并將其放在相同且適宜的溫度和pH條件下，一段時間后檢測試管中DNA分子放射性的有無。

【解析】

PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、延伸三步。在循環(huán)之前，常需要進行一次預(yù)變性，以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率。

PCR過程為：

變性，當溫度上升到90 ℃以上時，氫鍵斷裂，雙鏈DNA解旋為單鏈。

復(fù)性，當溫度降低到50℃左右是，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。

延伸，溫度上升到72 ℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。

（1）生物的遺傳物質(zhì)都是核酸，具有相似的組成成分和結(jié)構(gòu)；遺傳信息的傳遞都遵循中心法則（都遵循堿基互補配對原則）；所有生物共用一套密碼子，這是生物具有統(tǒng)一性的表現(xiàn)，正因如此，新型冠狀病毒（2019-nCoV）的相關(guān)蛋白才能在宿主細胞中進行正常表達。

（2）該反應(yīng)體系中，過程①為逆轉(zhuǎn)錄過程，需要逆轉(zhuǎn)錄酶，在該體系中需要使用TaqDNA聚合酶，該酶耐高溫，即熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活，因此在PCR技術(shù)中不使用大腸桿菌的DNA聚合酶。

（3）在反應(yīng)體系中，過程③需要首先加熱至90～95℃，此時模板DNA在高溫條件下變性，即其中的氫鍵斷裂，解開為單鏈，接著反應(yīng)體系中溫度降低，兩種引物分別與解開的兩條單鏈之間形成氫鍵完成中溫復(fù)性的過程，然后體系中溫度上升體系中的游離的脫氧核苷酸依次連在引物上開始中溫延伸過程，該過程中引物Ａ、Ｂ的作用是定位目的基因的位置，與模板鏈結(jié)合并為子鏈的延伸提供起點。

（4）題意顯示每一個擴增出來的DNA序列，都可與預(yù)先加入的一段熒光標記探針結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號，因此擴增出來的目的基因越多，產(chǎn)生的熒光信號越強，觀察到的Ct值就越大。

（5）一類RNA病毒能以自身RNA為模板直接進行RNA的復(fù)制；另一類以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成DNA，再以DNA為模板合成RNA，即逆轉(zhuǎn)錄病毒。為確定新型冠狀病毒是否是逆轉(zhuǎn)錄病毒，現(xiàn)要求用同位素標記法設(shè)計實驗進行證明，因此這里需要使胸腺嘧啶脫氧核苷酸帶上放射性標記，具體設(shè)計思路如下：首先設(shè)法將新型冠狀病毒破碎，獲取其提取液（其中含模板核酸），置于試管中，向試管中加入適量的放射性同位素標記的胸腺嘧啶脫氧核苷酸以及另外三種脫氧核苷酸、逆轉(zhuǎn)錄酶、ATP等原料，并將其放在適宜的條件下，一段時間后檢測試管中是否有放射性的DNA分子出現(xiàn)。