Question

【題目】變異鏈球菌在牙面的粘附、集聚是齲齒發(fā)生的先決條件。轉(zhuǎn)基因防齲疫苗是通過(guò)基因工程技術(shù)，將變異鏈球菌中與齲齒發(fā)生密切相關(guān)的抗原基因（PAcA基因）轉(zhuǎn)入植物的表達(dá)載體中，利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的基因工程疫苗。請(qǐng)回答下列相關(guān)問(wèn)題：

(1)轉(zhuǎn)基因植物的制備

單一使用PAcA基因，機(jī)體免疫應(yīng)答不理想，霍亂毒素中有增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的氨基酸序列（CTB)，將CTB基因與PAcA基因連接成嵌合（PAcA-CTB)基因，作為________與Ti質(zhì)粒的T-DNA拼接，構(gòu)建表達(dá)載體，此過(guò)程需要的酶是________。用_______法導(dǎo)入離體的黃瓜葉肉細(xì)胞中，經(jīng)植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株。相關(guān)基因能否在黃瓜細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是________。此基因疫苗起抗原作用的是_______(基因/蛋白質(zhì)）。

(2)轉(zhuǎn)基因植株目的基因的PCR鑒定與檢測(cè) 已知PAcA-CTB基因部分序列如下（左側(cè)為基因的首端）：

5'…CCGTGT……ATGCCT---3’

3'…GGCACA……TACGGA---5’

根據(jù)上述序列選擇引物________(填字母）進(jìn)行PCR。

A.引物：5'-GGCACA-3' B.引物：5，-AGGCAT-3'

C.引物：5'-CCGUGU-3' D.引物：5，-CCGTGT-3'

反應(yīng)結(jié)束后，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果如下圖（1來(lái)自未轉(zhuǎn)化植株，2是含PAcA-CTB基因的質(zhì)粒，3-8來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物)，從結(jié)果可以看出，________________號(hào)植物含有PAcA-CTB基因。若獲得的轉(zhuǎn)基因植物并沒(méi)有產(chǎn)生相應(yīng)的基因工程疫苗，根據(jù)中心法則分析，其可能的原因是_______。

Answer 1

【答案】目的基因 限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 相關(guān)基因是否整合到黃瓜的DNA分子上 蛋白質(zhì) BD 3、5、8 目的基因（PAcA-CTB）沒(méi)有轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄的mRNA沒(méi)有翻譯

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣.將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：

分子水平上的檢測(cè)：

①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；

②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；

③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。

個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

(1)轉(zhuǎn)基因植物的制備：?jiǎn)我皇褂?/span>PAcA基因，機(jī)體免疫應(yīng)答不理想，霍亂毒素中有增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的氨基酸序列（CTB)，將CTB基因與PAcA基因連接成嵌合（PAcA-CTB)基因，作為抗原目的基因與Ti質(zhì)粒的T-DNA拼接，構(gòu)建表達(dá)載體，此過(guò)程需要的酶是限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶。用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入離體的黃瓜葉肉細(xì)胞中，經(jīng)植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株。相關(guān)基因能否在黃瓜細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵是相關(guān)基因是否整合到黃瓜的DNA分子上。此基因疫苗起抗原作用的是基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)。

(2)已知PAcA-CTB基因部分序列如下（左側(cè)為基因的首端）：

5'…CCGTGT……ATGCCT---3’

3'…GGCACA……TACGGA---5’

由于PCR技術(shù)中，子鏈合成方向是從5到3’，因此應(yīng)該選擇引物BD進(jìn)行PCR。反應(yīng)結(jié)束后，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果如下圖（1來(lái)自未轉(zhuǎn)化植株，2是含PAcA-CTB基因的質(zhì)粒，3-8來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物)，從結(jié)果可以看出，3、5、8號(hào)植物含有PAcA-CTB基因。若獲得的轉(zhuǎn)基因植物并沒(méi)有產(chǎn)生相應(yīng)的基因工程疫苗，可能的原因是目的基因（PAcA-CTB）沒(méi)有轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄的mRNA沒(méi)有翻譯。