Question

【題目】CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術(shù)是近年來頗受關(guān)的一項新技術(shù)。該基因表達(dá)系統(tǒng)主要包含引RNA和Cas9蛋兩個部分，引導(dǎo)RNA能識別并結(jié)合特定的DNA序列，從而引導(dǎo)Cas9蛋白結(jié)合到相應(yīng)位置并剪切DNA，最終實現(xiàn)對靶基因序列的編輯。研究人員試圖CRISPR/Cas9系統(tǒng)對水稻產(chǎn)量基因Q基因進行編輯，請回答下列問題：

（1）研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas僅存在于原核生物，故需借助__________技術(shù)才能在水稻細(xì)胞中發(fā)揮作用。Cas9蛋白與__________酶的功能相似。

（2）首先依據(jù)__________的部分序列設(shè)計DNA片段A（負(fù)責(zé)編碼相應(yīng)引導(dǎo)RNA），再將片段A與含有Cas9基因的質(zhì)粒B連接，以構(gòu)建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因達(dá)載體（如圖所示），該過程中需要用到的兩類工具酶有________________。

（3）質(zhì)粒B大小為2．5kb（位點Ⅰ與位點Ⅱ相隔60b），經(jīng)酶切后的片段A大小為0．5kb（千堿基對），連接形成的表達(dá)載體大小為__________kb。

（4）常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)�入水稻受體細(xì)胞，依據(jù)農(nóng)桿菌的侵染特點，目的基因?qū)⒉迦氲?/span>Ti質(zhì)粒的__________上，經(jīng)過轉(zhuǎn)化作用，進入水稻細(xì)胞，并將其插入到__________，從而使其得以維持穩(wěn)定和表達(dá)。

（5）CRISRP/Cas基因編輯技術(shù)有時存在編輯對象出錯而造成脫靶，試從引導(dǎo)RNA的角度分析脫靶的原因____________________。

Answer 1

【答案】轉(zhuǎn)基因（DNA重組或基因工程） 限制酶 Q基因 限制酶和DNA連接酶 2.94kb T-DNA 水稻細(xì)胞染色體的DNA.上 其他DNA序列也含有與引導(dǎo)RNA互補配對的序列，造成引導(dǎo)RNA錯誤結(jié)合而脫靶

【解析】

1.基因工程的工具：

（1）限制酶：能夠識別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂。

（2）DNA連接酶：連接的是兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。

（3）運載體：常用的運載體：質(zhì)粒、噬菌體的衍生物、動植物病毒。

2.將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞的方法有：

將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞：采用最多的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)(農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法)，其次還有基因槍法和花粉管通道技術(shù)(花粉管通道法)。

將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞：最常用的方法是顯微注射技術(shù)。此方法的受休細(xì)胞多為受精卵；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞： Ca2+處理法。

（1）由于CRISPR/Cas僅存在于原核生物，若要讓CRISPR/Cas在真核細(xì)胞中起作用，需借助基因工程技術(shù)將其轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞中才能發(fā)揮作用。根據(jù)題干信息"Cas9蛋白結(jié)合到相應(yīng)位置并剪切DNA"，說明Cas9蛋白與限制酶的功能相似。

（2）由于是對水稻產(chǎn)量基因Q基因進行編輯，故首先需要依據(jù)Q基因的部分序列設(shè)計DNA片段A （負(fù)責(zé)編碼相應(yīng)引導(dǎo)RNA），再將片段A與含有Cas9基因的質(zhì)粒B連接，以構(gòu)建編輯水稻Q基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因表達(dá)載體。構(gòu)建基因表達(dá)載體需要用到限制酶和DNA連接酶。

（3）質(zhì)粒B大小為2. 5kb (位點l與位點lI相隔60b)，經(jīng)酶切后的片段A大小為0.5kb (千堿基對)，連接形成的表達(dá)載體大小為2.5+0.5-0.06=2.94kb。

（4）常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)�入水稻受體細(xì)胞，由于農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，故可將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，經(jīng)過轉(zhuǎn)化作用，進入水稻細(xì)胞，并將其插入到水稻細(xì)胞染色體的DNA上，從而使其得以維持穩(wěn)定和表達(dá)。

（5）由于其他DNA序列也含有與引導(dǎo)RNA互補配對的序列，造成引導(dǎo)RNA錯誤結(jié)合，從而導(dǎo)致CRISRP/Cas9基因編輯技術(shù)會出現(xiàn)編輯對象出錯而造成脫靶。