Question

【題目】在基因工程的操作過程中，有多種方法可檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體菌。回答下列問題：

（1）PCR檢測(cè)法：根據(jù)一段已知目的基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)______________，對(duì)受體菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過解鏈、______________、延伸三個(gè)步驟的循環(huán)，檢測(cè)PCR產(chǎn)物的長度是否與目的基因一致。

（2）熒光蛋白基因篩選法：某種熒光蛋白（GFP）在紫外線照射下會(huì)發(fā)出綠色熒光。用_____________酶將目的基因和GFP基因拼接成融合基因，并與____________重組后導(dǎo)入受體菌，經(jīng)培養(yǎng)篩選能發(fā)出綠色熒光的菌落。

（3）環(huán)絲氨酸輔助篩選法：四環(huán)素能使細(xì)菌停止生長但不致死；環(huán)絲氨酸能使正常生長的細(xì)菌致死，而對(duì)停止生長的細(xì)菌不致死。某質(zhì)粒如圖所示（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因），Tetr中插入目的基因后失活。用此質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，結(jié)果有3種：未轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌。

①用含有__________和____________的培養(yǎng)基對(duì)上述3種細(xì)菌進(jìn)行篩選，只有含質(zhì)粒的細(xì)菌被淘汰，理由是______________；

②在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選出含重組質(zhì)粒的細(xì)菌，還需使用含有的______________培養(yǎng)基。

Answer 1

【答案】引物 復(fù)性（退火） DNA連接 運(yùn)載體 四環(huán)素 環(huán)絲氨酸 含質(zhì)粒的細(xì)菌有Tetr，四環(huán)素對(duì)其不起作用，環(huán)絲氨酸使其致死 氨芐青霉素

【解析】

PCR原理：在解旋酶作用下，打開DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4種游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端自3'端延伸的，DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，PCR反應(yīng)過程是：變性→復(fù)性→延伸。基因工程操作中要用到限制酶、DNA連接酶、載體，限制酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，DNA連接酶用于連接目的基因和載體；根據(jù)質(zhì)粒圖顯示，質(zhì)粒中含有Ampr和Tetr，目的基因的插入位點(diǎn)位于Tetr中，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后有3種結(jié)果：未轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌、含重組質(zhì)粒的細(xì)菌，其中未轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上停止生長，含質(zhì)粒的細(xì)菌在四環(huán)素和氨芐青霉素培養(yǎng)基上能生長，含重組質(zhì)粒的細(xì)菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上停止生長，但在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能生長。

（1）PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)，前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物；對(duì)受體菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過解鏈、復(fù)性、延伸三個(gè)步驟的循環(huán)，檢測(cè)PCR產(chǎn)物的長度是否與目的基因一致。

（2）熒光蛋白基因篩選法：某種熒光蛋白（GFP）在紫外線照射下會(huì)發(fā)出綠色熒光。用DNA連接酶將目的基因和GFP基因拼接成融合基因，并與運(yùn)載體重組后導(dǎo)入受體菌，經(jīng)培養(yǎng)篩選能發(fā)出綠色熒光的菌落。

（3）①用含有四環(huán)素和環(huán)絲氨酸的培養(yǎng)基對(duì)上述3種細(xì)菌進(jìn)行篩選，只有含質(zhì)粒的細(xì)菌被淘汰，原因是含質(zhì)粒的細(xì)菌有Tetr，四環(huán)素對(duì)其不起作用，能正常生長，而環(huán)絲氨酸能使其致死。

②四環(huán)素能使細(xì)菌停止生長但不致死，環(huán)絲氨酸能使正常生長的細(xì)菌致死，而對(duì)停止生長的細(xì)菌不致死，先在含有四環(huán)素和環(huán)絲氨酸的培養(yǎng)基上篩選出未轉(zhuǎn)化的細(xì)菌和含重組質(zhì)粒的細(xì)菌，未轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在含四環(huán)素培養(yǎng)基上停止生長，環(huán)絲氨酸不使其致死，含重組質(zhì)粒的細(xì)菌由于四環(huán)素抗性基因被破壞，故在含四環(huán)素培養(yǎng)基上停止生長，而環(huán)絲氨酸對(duì)其不致死，重組質(zhì)粒在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能生長，若要篩選出含重組質(zhì)粒的細(xì)菌，還需使用含有的氨芐青霉素培養(yǎng)基。