Question

【題目】CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由Cas9蛋白（一種核酸酶）和sgRNA（向導RNA）構成的RNA-蛋白復合體，可利用sgRNA識別并結合特定DNA序列，引導Cas9蛋白對目的基因進行編輯（如圖所示）。RuBisCo是參與光合作用的關鍵酶，研究人員擬利用CRISPR/Cas9技術對大豆細胞RuBisCo基因進行定點編輯，以達到提高CO2利用率的目的，回答下列問題：

（1）利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因編輯時，Cas9蛋白可催化_______________（化學鍵名稱）水解，剪切特定DNA片段，因此Cas9蛋白的這一功能與_______________酶相似。

（2）用于編輯不同基因的CRISPR/Cas9復合物中sgRNA堿基序列不同，因此首先要確定RuBisCo基因中的待編輯序列，根據(jù)_______________原則設計引物，通過_______________技術擴增相應的基因序列，作為編碼特定sgRNA的模板。該技術所需的Taq酶特點是_______________，能使整個反應體系中DNA解鏈、退火、鏈的延伸都能快速進行。

（3）將擴增獲得的DNA片段與_______________基因共同導入到質粒載體，構建CRISPR/Cas9表達載體，將構建成功的表達載體通過_______________方法，導入大豆細胞。若檢測到受體細胞中組成RuBisCo酶的氨基酸_______________發(fā)生了符合預期的改變，則表明基因編輯成功。

（4）CRISPR/Cas9系統(tǒng)在定點編輯基因時仍存在一個最大的弊端，就是有很大概率會造成其他一些非目的基因序列的錯誤剪接和編輯，請嘗試分析其原因_______________。

Answer 1

【答案】磷酸二酯鍵 限制/限制性核酸內切 堿基互補配對 PCR 耐高溫 Cas9（蛋白） 農桿菌轉化/農桿菌 種類、數(shù)目、排列順序 其他基因序列也可能含有能與SgRNA互補配對的序列，造成SgRNA和Cas9的錯誤結合并且剪切

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：

分子水平上的檢測：

①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；

②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；

③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。

個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）Cas9蛋白能剪切特定DNA片段，這與限制酶的功能相似，可催化DNA中磷酸二酯鍵水解。

（2）要確定RuBisCo基因中的待編輯序列，可根據(jù)堿基互補配對原則設計引物，通過 PCR技術擴增相應的基因序列，作為編碼特定sgRNA的模板。該技術所需的Taq酶能耐高溫，使整個反應體系中DNA解鏈、退火、鏈的延伸都能快速進行。

（3）要構建CRISPR/Cas9表達載體，需要將擴增獲得的DNA片段與Cas9蛋白基因共同導入到質粒載體，將表達載體導入植物細胞通常采用農桿菌轉化法。若檢測到受體細胞中組成RuBisCo酶的氨基酸種類、數(shù)目、排列順序發(fā)生了符合預期的改變，則表明基因編輯成功。

（4）因其他基因序列也可能含有能與SgRNA互補配對的序列，造成SgRNA和Cas9的錯誤結合并且剪切，這會導致CRISPR/Cas9系統(tǒng)在定點編輯基因時有很大概率會造成其他一些非目的基因序列的錯誤剪接和編輯。