Question

【題目】研究人員利用小鼠的單倍體ES細(xì)胞（只有一個染色體組），成功培育出轉(zhuǎn)基因小鼠。其主要技術(shù)流程如圖所示，請分析回答下列問題：

注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ代表四種限制酶。箭頭指向的位置為限制酶的切割位置：Amp是氨芐青霉素抗性基因，Neo是G418抗性基因。

（1）利用PCR技術(shù)可以擴(kuò)增目的基因，PCR反應(yīng)體系中除含授沖液、模板DNA、dNTP(包含dNTP、dATO、dcTP、dGTP、dTTP）、引物以外，還應(yīng)含有_______；引物應(yīng)選用下圖中的 _____（填圖中標(biāo)號）。

（2）已知氨芐青霉素不能有效殺死小鼠細(xì)胞，而一定濃度的G418能有效殺死不具有Neo的小鼠細(xì)胞。結(jié)合上圖推測，過程①選用的2種限制酶是______（選填圖中的編號），③處的培養(yǎng)液應(yīng)添加_____（填“氨芐青霉素”或“G418”）

（3）細(xì)胞乙與____類似，圖中桑椹胚需要通過_____技術(shù)移入代孕小鼠子宮內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，進(jìn)行該操作前需對小鼠進(jìn)行_____處理。

Answer 1

【答案】Taq酶(或耐高溫的DNA聚合酶） A和D I 和 II G418 受精卵 胚胎移植 同期發(fā)情

【解析】

PCR是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)，該技術(shù)可以在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因。步驟：變性→復(fù)性→延伸。PCR反應(yīng)的條件：模板DNA、dNTP（包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、引物、耐高溫的DNA聚合酶，其中，dNTP的作用是合成DNA的原料、提供能量。

圖中用限制酶Ⅰ、Ⅱ切割質(zhì)粒會破壞氨芐青霉素抗性基因，保留G418抗性基因；用限制酶Ⅲ、Ⅳ切割質(zhì)粒會破壞G418抗性基因，保留氨芐青霉素抗性基因。不能用Ⅰ、Ⅳ或Ⅱ、Ⅲ同時切割，會同時破壞兩個抗性基因。

圖中2構(gòu)建基因表達(dá)載體，之后把目的基因?qū)�入小鼠單倍體ES細(xì)胞中，去其核與次級卵母細(xì)胞的進(jìn)行融合，類似于受精作用。

（1）根據(jù)分析可知，PCR反應(yīng)體系中除含緩沖液、模板DNA、dNTP（包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、引物以外，還應(yīng)含有耐高溫的DNA聚合酶。為了擴(kuò)增目的基因的片段，根據(jù)圖示可知需要在引物A和D作用下以目的基因的兩條鏈為模板合成子代目的基因。

（2）由圖可知，過程①②是將目的基因和運(yùn)載體連接形成重組質(zhì)粒，即基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程。重組質(zhì)粒上的抗生素抗性基因可作為標(biāo)記基因，其作用是有利于篩選出含有目的基因的細(xì)胞。根據(jù)題意可知，氨芐青霉素不能有效殺死小鼠細(xì)胞，而一定濃度的G418能有效殺死不具有Neo′的小鼠細(xì)胞，因此應(yīng)選擇Neo′作為標(biāo)記基因，即質(zhì)粒上Neo′不能用限制酶切割，則過程①應(yīng)選用Ⅰ和Ⅱ兩種限制酶，圖中③處的培養(yǎng)液應(yīng)添加G418以便于起到篩選的作用。

（3）處理形成的細(xì)胞乙與受精卵類似，應(yīng)用早期胚胎培養(yǎng)技術(shù)可以使其發(fā)育成桑椹胚。再將桑椹胚通過胚胎移植技術(shù)移入代孕小鼠子宮內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，進(jìn)行該操作前需對受體小鼠進(jìn)行同期發(fā)情處理，以保證供體與受體處于相同或相近的生理狀態(tài)。