Question

【題目】Period2（Per2）基因是一種抑癌基因，干擾Per2基因表達(dá)有利于腫瘤細(xì)胞存活和促進(jìn)腫瘤發(fā)生。p53腫瘤抑制因子是一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)DNA修復(fù)、細(xì)胞周期、衰老凋亡等相關(guān)細(xì)胞途徑，是抵抗癌癥發(fā)病和進(jìn)展的重要防御因子，并且是通過(guò)與癌蛋白MDM2負(fù)調(diào)控作用調(diào)節(jié)其功能。為探究裸鼠體內(nèi)下調(diào)Per基因?qū)θ四z質(zhì)瘤細(xì)胞U343細(xì)胞株中P53的可能調(diào)控機(jī)制，科研人員做了如下實(shí)驗(yàn)：

Ⅰ．裸鼠膠質(zhì)瘤模型構(gòu)建

（1）培養(yǎng)U343細(xì)胞常在培養(yǎng)基中加入____________，一段時(shí)間后用________________消化，制成細(xì)胞懸液。

（2）人工合成低表達(dá)Per2基因，以某種病毒作為運(yùn)載體，構(gòu)建重組DNA，導(dǎo)入到培養(yǎng)好的U343膠質(zhì)瘤細(xì)胞中（實(shí)驗(yàn)組），同時(shí)還需要設(shè)置2組對(duì)照組，分別為：________________（對(duì)照組1）、空白對(duì)照組（U343）（對(duì)照組2）。

（3）每組等量同齡健康裸鼠，皮下相同部位分別對(duì)應(yīng)注入上述組別的U343細(xì)胞，適宜條件下培養(yǎng)，定期記錄瘤體體積，記錄到成瘤（體積達(dá)1000mm3）的時(shí)間，處死小鼠，取出瘤體，提RNA和蛋白質(zhì)。

II．實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（4）實(shí)驗(yàn)組小鼠成瘤時(shí)間短于兩對(duì)照組，且相同時(shí)間內(nèi)實(shí)驗(yàn)組瘤體體積大于兩對(duì)照組。

（5）檢測(cè)各組U343膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Per2 蛋白含量（各組mRNA含量關(guān)系同Per2蛋白含量關(guān)系），如圖1所示。

注：圖中從左向右依次為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組1、對(duì)照組2。

由圖1結(jié)果可知，細(xì)胞中GAPDH蛋白表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，在實(shí)驗(yàn)中可作為參照，作用是____________________________。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組Per2基因低表達(dá)體系構(gòu)建成功。

（6）已知當(dāng)DNA損傷后，DNA檢測(cè)點(diǎn)基因ATM被激活，隨后誘發(fā)p53激活，而c-myc是原癌基因，p53可與c-myc的啟動(dòng)子相結(jié)合發(fā)生乙�；�反應(yīng)，已知c-myc的轉(zhuǎn)錄，相關(guān)基因表達(dá)后蛋白檢測(cè)如圖2（各組mRNA含量關(guān)系同蛋白含量關(guān)系）

注：圖中從左向右依次為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組1、對(duì)照組2。

由圖2可推測(cè)，Per2基因的作用為：____________________________________。

III．下調(diào)Per基因?qū)θ四z質(zhì)瘤細(xì)胞U343細(xì)胞株中P53的可能調(diào)控機(jī)制

（7）綜上，Per2基因低表達(dá)可明顯促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，請(qǐng)你提出一種可能的調(diào)控機(jī)制：________________________________________________________，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。

Answer 1

【答案】血清（血漿） 胰蛋白酶（膠原蛋白酶） 轉(zhuǎn)入同種病毒到U343膠質(zhì)瘤細(xì)胞中 排除細(xì)胞培養(yǎng)操作、點(diǎn)樣量、檢測(cè)方法等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 Per2高表達(dá)促進(jìn)p53、ATM表達(dá)，抑制c-myc和MDM2表達(dá) Per2基因低表達(dá)時(shí)，抑制了p53和ATM的表達(dá)，促進(jìn)了MDM2和c-myc的表達(dá)，MDM2負(fù)調(diào)控P53，使p53表達(dá)量更低

【解析】

1、通常采用機(jī)械消化或胰酶消化動(dòng)物組織，使其分散為單個(gè)細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)：適宜的培養(yǎng)基、添加血清、激素（如胰島素）等。

2、由于生物實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象存在差異性，大多采用對(duì)照實(shí)驗(yàn)法，即確定實(shí)驗(yàn)組后，根據(jù)等量原則和單一變量原則設(shè)計(jì)相應(yīng)對(duì)照組。

Ⅰ．（1）動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)除了需要碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和水分之外，還需要各種生長(zhǎng)因子。因此，培養(yǎng)U343細(xì)胞常在培養(yǎng)基中加入血清，為動(dòng)物細(xì)胞提供生長(zhǎng)因子。培養(yǎng)一段時(shí)間后，可用胰蛋白酶或膠原蛋白酶消化，使細(xì)胞分散開制成細(xì)胞懸液。

（2）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾骄柯闶篌w內(nèi)下調(diào)Per基因?qū)θ四z質(zhì)瘤細(xì)胞U343細(xì)胞株中P53的可能調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)變量：細(xì)胞中是否含有Per基因。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：①實(shí)驗(yàn)組：人工合成低表達(dá)Per2基因，以某種病毒作為運(yùn)載體，構(gòu)建重組DNA，導(dǎo)入到培養(yǎng)好的U343膠質(zhì)瘤細(xì)胞中（實(shí)驗(yàn)組）。②對(duì)照組1：為了排除病毒對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，將同種病毒轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)好的U343膠質(zhì)瘤細(xì)胞中。③對(duì)照組2：作為空白對(duì)照，培養(yǎng)好的U343膠質(zhì)瘤細(xì)胞。

II．（5）由圖1可知，細(xì)胞中GAPDH蛋白表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，在實(shí)驗(yàn)中可作為參照，可排除細(xì)胞培養(yǎng)操作、點(diǎn)樣量、檢測(cè)方法等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)組U343膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Per2 蛋白含量比對(duì)照組1和對(duì)照組2U343膠質(zhì)瘤細(xì)胞的低，說(shuō)明Per2基因在實(shí)驗(yàn)組U343膠質(zhì)瘤細(xì)胞中成功表達(dá)，即Per2基因低表達(dá)體系構(gòu)建成功。

（6）由圖2可知，細(xì)胞中GAPDH蛋白表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，可排除細(xì)胞培養(yǎng)操作、點(diǎn)樣量、檢測(cè)方法等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。Per2蛋白含量與p53、ATM的含量成正比，說(shuō)明Per2高表達(dá)促進(jìn)p53、ATM的表達(dá)。Per2蛋白含量與c-myc和MDM2的含量成反比，說(shuō)明Per2高表達(dá)抑制c-myc和MDM2的表達(dá)。

III．（7）由（6）的結(jié)果可知，Per2基因低表達(dá)時(shí)，抑制p53、ATM的表達(dá)，促進(jìn)c-myc和MDM2的表達(dá)，而MDM2的表達(dá)可負(fù)調(diào)控P53，使p53的表達(dá)量更低，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。