Question

【題目】癌細(xì)胞表面蛋白“PDL-1”與T細(xì)胞表面蛋白“PD-1”特異性結(jié)合后，可抑制T細(xì)胞活性并啟動(dòng)其凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫“逃逸”。研究者對(duì)“PD-1”基因進(jìn)行克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性鑒定，為制備抗體打基礎(chǔ)。研究中所用引物α和β堿基序列見圖1、幾種常用限制酶名稱及識(shí)別序列與酶切位點(diǎn)見圖2：

α鏈：5'-T C A C T C G A G A C C A T G C A G A T C C C A C A G G C G C C C-3' β鏈：5'-C T C G A A T T C T C A G A G G G G C C A A G A G C A G T G-3' 圖1

（1）首先提取細(xì)胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄生成____________________作為模板；設(shè)計(jì)含有不同的限制酶切點(diǎn)的α和β序列為引物，通過____________________技術(shù)擴(kuò)增目的基因。

（2）選用圖1中的兩種名稱分別為____________________的限制酶將“pIRES2-EGFP質(zhì)�！陛d體進(jìn)行雙切，再用DNA連接酶將其與目的基因拼接，構(gòu)建表達(dá)載體。該表達(dá)載體的組成，除了目的基因、標(biāo)記基因抗卡那霉素基因外，還必須具有____________________等。

（3）而后一定溫度下，與經(jīng)過處理的感受態(tài)大腸桿菌混合培養(yǎng)在含有_____________培養(yǎng)基中，可篩選出已經(jīng)完成轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，繼續(xù)培養(yǎng)該種大腸桿菌以擴(kuò)增重組DNA。

（4）將擴(kuò)增后的“pIRES2-EGFP載體/PD-1重組DNA”轉(zhuǎn)入可高度表達(dá)外源基因的原代293T細(xì)胞。一段時(shí)間后，為確定PD-1基因是否表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞膜表面是否具有____________________。為判斷其是否具有生物學(xué)活性和功能，則可裂解293T細(xì)胞，提取該物質(zhì)看能否與____________________發(fā)生結(jié)合，從而阻斷“PD-1與PDL-1信號(hào)通路”。研究中還會(huì)有一步驟，只將“pIRES2-EGFP載體”轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，其目的是_________________________。

Answer 1

【答案】cDNA PCR Xho I EoR I 啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn) 卡那霉素 PD-1蛋白 PDL-1或答PD-1抗體 作為對(duì)照

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因采用DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA采用分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)采用抗原—抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）基因文庫包括基因組文庫和部分基因文庫（cDNA）。其中基因組文庫包含某種生物所有的基因，而部分基因文庫只包含某種生物的部分基因，可以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄形成cDNA；由于PCR技術(shù)利用的是DNA分子復(fù)制的原理，所以用該cDNA進(jìn)行PCR技術(shù)擴(kuò)增短時(shí)間內(nèi)可以獲得大量的目的基因。

（2）分析圖1中堿基序列，α鏈上有“—CTCGAC—”識(shí)別序列，β鏈上有“—GAATTC—”堿基識(shí)別序列，與圖2中XhoI限制酶和EoRI限制酶的識(shí)別序列相同。故選用XhoI限制酶和EoRI限制酶將“pIRES2-EGFP質(zhì)�！陛d體進(jìn)行雙切，再用DNA連接酶將其與目的基因拼接，構(gòu)建基因表達(dá)載體。基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)等。

（3）根據(jù)第（2）題可知，基因表達(dá)載體上的標(biāo)記基因是卡那霉素抗性基因，因此一定溫度下，與經(jīng)過 Ca2+處理的感受態(tài)大腸桿菌混合培養(yǎng)在含有卡那霉素的培養(yǎng)基，可篩選出已經(jīng)完成轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。

（4）基因表達(dá)的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，一段時(shí)間后，為確定PD-1基因是否表達(dá)，可以檢測(cè)細(xì)胞膜表面是否具有PD-1基因表達(dá)的PD-1蛋白。為判斷其是否具有生物學(xué)活性和功能，可采用抗原—抗體雜交技術(shù)，即從裂解293T細(xì)胞中，提取PD-1蛋白看能否與PDL-1發(fā)生結(jié)合，從而阻斷“PD-1與PDL-1信號(hào)通路”。為了增加實(shí)驗(yàn)的可信度，還需要設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)，只將“pIRES2-EGFP載體”轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，因?yàn)椴缓?/span>PD-1基因，所以“PD-1與PDL-1信號(hào)通路”不會(huì)阻斷。