Question

【題目】PCR擴增過程示意圖如下，核心要素包括引物設(shè)計、溫度控制和模板DNA的獲得。請回答下列問題：

（1）欲構(gòu)建抗利尿激素的cDNA文庫，應(yīng)從________(組織)中提取________，通過________獲得cDNA用于PCR擴增。

（2）設(shè)計一對與抗利尿激素基因兩端序列互補配對的引物時(引物1和引物2)，一般在引物的________端需要增加適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钗稽c，其目的是____________________________。

（3）PCR設(shè)計的引物序列一般介于20～30 bp，若引物序列太長帶來的影響主要是______________________________________。

（4）PCR擴增時，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度的設(shè)定主要與________________有關(guān)。

（5）如果模板DNA完全正常，但PCR反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物，其原因可能為____________、____________。

Answer 1

【答案】下丘腦 總mRNA 逆轉(zhuǎn)錄 5′ 便于酶切后構(gòu)建基因表達載體（重組質(zhì)粒） PCR特異性提高，但是引物與模板鏈的結(jié)合效率降低 引物長度、堿基組成 退火溫度太高 引物設(shè)計錯誤

【解析】

利用PCR技術(shù)擴增目的基因：PCR是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，原理：DNA雙鏈復(fù)制；過程：第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈（變性）；第二步：冷卻到55～60℃，引物結(jié)合到互補DNA鏈（退火）；第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始進行互補鏈的合成（延伸）；擴增目的基因的前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。

（1）下丘腦分泌抗利尿激素，所以欲構(gòu)建抗利尿激素的cDNA文庫，應(yīng)從下丘腦中提取總mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄等過程獲得cDNA用于PCR擴增。這里提取mRNA是無法選擇的，只能將所有mRNA均提取出來，在PCR時可以通過設(shè)計特異性的引物來達到PCR擴增某基因的目的。

（2）PCR是基因工程的第一步，為了后續(xù)構(gòu)建基因表達載體，在設(shè)計一對與抗利尿激素基因兩端序列互補配對的引物時（引物1和引物2），一般在引物的5′端需要增加適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钗稽c。

（3）PCR設(shè)計的引物序列一般介于20～30bp，若引物序列太長帶來的影響主要是擴增效率降低，而引物太短又容易導(dǎo)致異常DNA的產(chǎn)生。

（4）PCR擴增時，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度的設(shè)定主要與引物長度和堿基組成中G-C比例呈正相關(guān)。

（5）如果退火溫度太高，引物無法與模版鏈結(jié)合，所以如果模板DNA完全正常，但PCR反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物，其原因可能為退火溫度太高或引物設(shè)計錯誤（無法與任何模板鏈結(jié)合，無法進行DNA復(fù)制）