Question

【題目】閱讀下面的材料，完成（1）～（5）題。

科研人員建立了一種新的靶向基因敲除技術——TALEN技術（原理見下圖）。TALEN技術使用的基因敲除工具是由DNA識別域和核酸內切酶兩個部分組成的蛋白質。科學家發(fā)現(xiàn)了一種細菌蛋白質（TALE），它的二連氨基酸（NI、NG、HD、NN，其中字母N、I、G、H、D分別代表了一種氨基酸）與四種堿基（A、G、C、T）有恒定的對應關系：NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G。FokⅠ是一種形成二聚體后具有核酸內切酶活性的蛋白單體。因此，可以利用TALE作為DNA識別域，用FokⅠ二聚體定點切斷DNA。

科學家發(fā)現(xiàn)水稻植株無論是否具有光周期敏感蛋白基因P，在短日照條件下均表現(xiàn)為雄性可育。在長日照條件下，具有光周期敏感蛋白的水稻才能雄性可育。基因P只在單倍體花粉細胞中表達，使其能夠合成淀粉。科研人員使用TALEN技術對水稻基因P進行靶向敲除，以得到光敏雄性不育水稻新品種。

（1）在TALEN技術的設計中，選擇使用FokⅠ單體而不直接使用FokⅠ二聚體，這樣能減少對DNA的__________切割，保證了基因敲除的靶向性。為了讓TALEN技術能用于各種不同生物、不同基因的敲除，沒有與TALE蛋白結合的FokⅠ二聚體對DNA的切割應__________（選填“具有”或“不具有”）類似于限制酶的“限制性”。

（2）若TALE蛋白左臂所識別的基因P的序列為“-TGACC-” ，則TALE蛋白左臂對應的二連氨基酸序列應為__________。用這種方法，可以確定TALE蛋白的氨基酸序列，進而人工合成TALE蛋白基因。然后將TALE蛋白基因與__________基因進行融合，得到融合基因。

（3）科研人員用圖2所示的質粒為載體，其中的潮霉素抗性作為標記基因，作用是__________。應選用__________酶將該質粒與融合基因構建為重組質粒，并將融合基因設法導入到水稻愈傷組織中，再利用__________技術獲得T0代植株。

（4）由于基因靶向敲除成功的概率比較低，所以科研人員培育T0代植株時應保證__________日照條件，待其自花受粉得到T1代，再將T1代植株__________，并在開花期隨機選擇一部分植株的花粉進行鑒定，鑒定方法是__________。若觀察到某植株的花粉全部未被染成藍色，則該植株為所需的純合光敏雄性不育新品種。

（5）與傳統(tǒng)的雄性不育水稻品種相比，光敏雄性不育新品種的優(yōu)勢在于它能實現(xiàn)自交繁殖并保留雄性不育特性，這是因為__________。

Answer 1

【答案】非靶向（或“隨機”） 不具有 FokⅠ單體 篩選轉化成功的受體細胞 BamH Ⅰ及DNA連接 植物組織培養(yǎng) 短 在長日照下種植 將花粉用碘液染色后，在顯微鏡下觀察 光敏雄性不育新品種在短日照條件下雄性可育，可實現(xiàn)自交繁殖；自交后代能保持基因P敲除的純合性，使其在長日照條件下雄性不育

【解析】

分析題干的信息：細菌蛋白質（TALE）與四種堿基（A、G、C、T）有恒定的對應關系，FokⅠ是一種形成二聚體后具有核酸內切酶活性的蛋白單體。

水稻植株無論是否具有光周期敏感蛋白基因P，在短日照條件下均表現(xiàn)為雄性可育。在長日照條件下，具有光周期敏感蛋白的水稻才能雄性可育。

基因P只在單倍體花粉細胞中表達，使其能夠合成淀粉。

（1）如果使用FokⅠ二聚體，根據(jù)圖示，可以對靶基因的左側和右側序列進行隨機切割，所以為了較少對DNA的隨機（非靶向）切割，保證了基因敲除的靶向性。由于限制酶的特點是識別特定的序列并在特定的位點進行切割，所以應選擇不具有類似于限制酶的“限制性”。

（2）根據(jù)NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G，所以二連氨基酸序列應為，融合基因可以將TALE蛋白基因和FokⅠ單體基因進行融合，如果表達后就可以獲得具有特異性識別并且切割的酶。

（3）在基因工程中，標記基因的作用是篩選轉化成功的受體細胞，根據(jù)啟動子的啟動方向可知，用HindⅢ酶處理，目的基因插入的位置是表達不出來的，所以選擇BamHⅠ進行切割，并用同種酶處理目的基因，再用DNA連接酶形成重組質粒，將融合基因設法導入到水稻愈傷組織中后，在利用植物組織培養(yǎng)技術獲得T0代植株。

（4）由于在短日照條件下均表現(xiàn)為雄性可育，在長日照條件下，具有光周期敏感蛋白的水稻才能雄性可育，所以T0代應該保證短日照條件，獲得F1代后將其放入長日照下種植，淘汰沒有光周期蛋白的個體，然后進行花粉鑒定，因為基因P只在單倍體花粉細胞中表達，使其能夠合成淀粉，所以可以用碘液染色。

（5）由于光敏雄性不育新品種在短日照條件下雄性可育，可實現(xiàn)自交繁殖；自交后代能保持基因P敲除的純合性，使其在長日照條件下雄性不育，所以與傳統(tǒng)的雄性不育水稻品種相比，光敏雄性不育新品種的優(yōu)勢在于它能實現(xiàn)自交繁殖并保留雄性不育特性。