Question

【題目】圖1是科研工作者利用差異雜交法獲取相關(guān)目的基因的研究；圖2是克隆出的花色基因C，和實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒表達(dá)載體簡圖（箭頭所指分別為限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI、BamlI的酶切位點(diǎn)，ampR為青霉素抗性基因，tetR為四環(huán)素抗性基因，P為啟動(dòng)子，T為終止子，ori為復(fù)制原點(diǎn)），擬將其與質(zhì)粒重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。請據(jù)圖回答問題：

(1)圖1中，A過程需要用____________酶，D過程需要篩選____________（填“未雜交”或“雜交分子”）的含32P的cDNA單鏈，繼而通過人工合成，獲得雙鏈cDNA，并用其構(gòu)建基因文庫。

(2)圖2中菊花組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基常用_________方法滅菌。菊花的組織培養(yǎng)過程③需添加生長素和細(xì)胞分裂素，當(dāng)其比值_________（升高/降低/適中）促進(jìn)生根。

(3)圖3表示運(yùn)用影印培養(yǎng)法（使一系列培養(yǎng)皿的相同位置上能出現(xiàn)相同菌落的一種接種培養(yǎng)方法）檢測基因表達(dá)載體是否導(dǎo)入了農(nóng)桿菌。培養(yǎng)基除了含有細(xì)菌生長繁殖必需的成分外，培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B分別還含有__________、__________。從檢測篩選的結(jié)果分析，含有目的基因的是___________（填數(shù)字）菌落中的細(xì)菌。

(4)為確定基因C是否整合到菊花染色體的DNA上，可用放射性同位素標(biāo)記的___________作為探針進(jìn)行分子檢測，還需要在個(gè)體水平上通過_________鑒定。

(5)本實(shí)驗(yàn)中，對質(zhì)粒進(jìn)行酶切時(shí)，只能單一酶切，不能雙酶切，原因是____________。為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。下圖所示為6條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對引物是______________可以擴(kuò)增出了450bp片段。若目的基因反向連接了，那么選圖中引物__________，可從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了500bp片段。

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Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄 未雜交 高壓蒸汽滅菌 升高 青霉素（ampR） 四環(huán)素（tetR）（或ampR和tetR） 4和6 基因C 觀察花色 基因c只有EcoRI的酶切位點(diǎn)，當(dāng)質(zhì)粒被同一種酶切割后產(chǎn)生同樣的末端基因C才能和質(zhì)粒連接成環(huán)狀（只答基因C只有EcoRI的酶切位點(diǎn)即可） db bc

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因：DNA-DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA：DNA-RNA分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)：抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

分析圖2：圖示為轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的培育過程，首先構(gòu)建基因表達(dá)載體；其次采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞（煙草細(xì)胞）；再采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)將含有目的基因的煙草細(xì)胞培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草。

分析圖3：圖2是篩選含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌的過程，培養(yǎng)基A和B中應(yīng)該分別加入氨芐青霉素、四環(huán)素。

（1）據(jù)圖可知圖1為構(gòu)建基因文庫的過程，其中需要單鏈mRNA通過A過程形成雜交雙鏈分子，需要逆轉(zhuǎn)錄酶，D過程需要回收未雜交的含32P的cDNA單鏈，繼而通過人工合成，獲得雙鏈cDNA，并用其構(gòu)建基因文庫。

（2）培養(yǎng)基通過采用高壓蒸汽滅菌法處理。菊花的組織培養(yǎng)過程③需添加生長素和細(xì)胞分裂素，當(dāng)生長素比值增大時(shí)有利于生根。

（3）用EcoRI、BamlI兩種限制酶對質(zhì)粒進(jìn)行切割時(shí)，會(huì)破會(huì)四環(huán)素抗性基因，但不會(huì)破壞氨芐青霉素抗性基因，因此導(dǎo)入重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能生存，但不能在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上生存，所以培養(yǎng)基A和培養(yǎng)基B分別還含有氨芐青霉素、四環(huán)素，含目的基因的是4和6菌落中的細(xì)菌。

（4）為確定基因C是否整合到菊花染色體的DNA上，可用放射性同位素標(biāo)記的基因C為探針進(jìn)行分子檢測，由于基因C控制花色的形成，因此還需要在個(gè)體水平上通過觀察花色進(jìn)行鑒定。

（5）據(jù)圖分析，根據(jù)目的基因插入的位置和PCR技術(shù)的原理分析，PCR技術(shù)要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合，沿著相反的方向合成子鏈，因此要擴(kuò)增出450bp片段，PCR鑒定時(shí)應(yīng)該選擇的一對引物是db；根據(jù)題意和圖形分析，若目的基因發(fā)生了反向連接，用圖中的另外一對引物bc從某一菌落的質(zhì)粒中可以擴(kuò)增出500bp的片段。