Question

【題目】Sanger法DNA測(cè)序的核心原理：由于雙脫氧核苷酸（ddNTP）五碳糖的2'和3'碳原子都不含羥基，在DNA合成過(guò)程中不能形成“相應(yīng)化學(xué)鍵”，因此可中斷DNA分子合成反應(yīng)。在四個(gè)含有4種脫氧核苷酸（dNTP）的PCR反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的 ddNTP（分別為ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），在PCR過(guò)程中復(fù)制隨機(jī)終止，產(chǎn)生四組不同長(zhǎng)度的一系列終止處帶有標(biāo)記的DNA片段，如圖1。然后在變性凝膠上進(jìn)行電泳和放射自顯影后，可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測(cè)分子的DNA序列，具體過(guò)程見(jiàn)下圖2。（注：ddA是ddATP的縮寫(xiě)形式）

（1）題干中“相應(yīng)化學(xué)鍵”是_____，圖1過(guò)程Ⅰ橫線①處加入的物質(zhì)的特點(diǎn)是________，該過(guò)程需要添加引物的原因是______________________。

（2）題干中“在變性凝膠上進(jìn)行電泳……”中“變性”是指__________，其目的是_________________。

（3）某同學(xué)要通過(guò)PCR技術(shù)獲得被32P標(biāo)記且以堿基“C”為末端、不同長(zhǎng)度的子鏈DNA片段，在反應(yīng)管中已有模板、引物、酶和相應(yīng)緩沖液等，還需加入的原料有__________________。

（4）若模板鏈?zhǔn)恰?/span> 3' …TCAGCTCGAATC…5' ”，變性后電泳結(jié)果如圖2所示，則模板DNA電泳后所處的位置最可能為____（選填“a處”或“b處”），原因是__________。

Answer 1

【答案】磷酸二酯鍵 耐高溫 DNA聚合酶只能將游離的脫氧核苷酸添加到已有核酸片段上 破壞DNA分子中氫鍵，獲得單鏈 避免模板鏈對(duì)結(jié)果的影響（或使模板鏈與子鏈分離，使電泳結(jié)果直接反映子鏈的長(zhǎng)度，便于讀序） dATP、dGTP、dTTP、dCTP 、ddCTP b處 模板DNA長(zhǎng)度最長(zhǎng)（分子量最大）

【解析】

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)，PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。PCR的條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。PCR的過(guò)程：①高溫變性：DNA解旋過(guò)程；②低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開(kāi)不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開(kāi)。

（1）DNA分子合成是以DNA的兩條鏈為模板，以游離的脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，題干中“相應(yīng)化學(xué)鍵”是磷酸二酯鍵，連接脫氧核苷酸成子鏈。圖1過(guò)程Ⅰ橫線①處加入的物質(zhì)為TaqDNA聚合酶，特點(diǎn)是耐高溫。該過(guò)程需要添加引物的原因是DNA聚合酶只能將游離的脫氧核苷酸添加到已有核酸片段上，需由引物先跟模板結(jié)合。

（2）PCR是體外合成DNA的方式，“變性”是指破壞DNA分子中氫鍵，獲得單鏈。其目的是避免模板鏈對(duì)結(jié)果的影響（或使模板鏈與子鏈分離，使電泳結(jié)果直接反映子鏈的長(zhǎng)度，便于讀序）。

（3）在反應(yīng)管中已有模板、引物、酶和相應(yīng)緩沖液等，還需加入的原料有dATP、dGTP、dTTP、dCTP 、ddCTP，那么子鏈會(huì)在堿基“C”的地方停止合成。

（4）若模板鏈?zhǔn)?/span>“ 3' …TCAGCTCGAATC…5' ”，變性后電泳結(jié)果如圖2所示，則模板DNA電泳后所處的位置最可能為b處，原因是模板DNA長(zhǎng)度最長(zhǎng)（分子量最大）。