【題目】下圖1是獲取用于構(gòu)建基因表達(dá)載體的含人生長(zhǎng)激素基因的DNA片段(DNA復(fù)制子鏈延伸方向是5′→3′,轉(zhuǎn)錄方向?yàn)樽蟆?示意圖,圖2是所用質(zhì)粒示意圖,其上的Ampr表示青霉素抗性基因,Tett表示四環(huán)素抗性基因。有關(guān)限制酶的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)如下表。請(qǐng)據(jù)圖回答:

限制酶識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)表

限制酶

HindⅢ

BamHⅠ

Pst

EcoRⅠ

Sma

Bgl

識(shí)別序列(5′→3′)

AAGCTT

GGATCC

CTGCAG

GAATTC

CCCGGG

AGATCT

(1) ①過程催化形成磷酸二酯鍵的酶有____________________,合成的人生長(zhǎng)激素基因中________(選填“有”或“無”)與終止密碼子相應(yīng)的堿基序列。

(2) 引物1由5′→3′的堿基序列為________________________,引物2應(yīng)含有限制酶________的識(shí)別序列;從圖1的過程②開始進(jìn)行PCR擴(kuò)增,第六次循環(huán)結(jié)束時(shí),圖中用于構(gòu)建基因表達(dá)載體的DNA片段所占比例是________

(3) 在構(gòu)建表達(dá)載體的過程中對(duì)圖中質(zhì)粒、DNA片段進(jìn)行合適的完全酶切后,向兩者的混合物中加入DNA連接酶,若只考慮DNA切段兩兩連接,則混合物中將形成________種環(huán)狀DNA。

(4) 2018年11月基因編輯嬰兒事件震驚了世界,輿論一片嘩然,某科研團(tuán)隊(duì)利用“CRISPR/Cas9”技術(shù)將受精卵中的艾滋病病毒受體基因CCR5進(jìn)行修改,擬培育出具有艾滋病免疫能力的基因編輯嬰兒。下圖3為向?qū)NA引導(dǎo)Cas9蛋白切割CCR5基因(目標(biāo)DNA)示意圖。

①向?qū)NA的合成需要________酶。Cas9蛋白是一種________酶。

②“GRISPR/Cas9”技術(shù),是利用________法將Cas9蛋白和特定的引導(dǎo)序列導(dǎo)入受精卵中發(fā)揮基因編輯作用。

③基因編輯嬰兒引起輿論的關(guān)注,很多科學(xué)家表示反對(duì),請(qǐng)給出合理的理由______________。

【答案】反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶 AGATCTGCATCCTCCAGG BamHⅠ 13/16 6 RNA聚合 限制 顯微注射 細(xì)胞內(nèi)DNA上可能不止一個(gè)Cas9酶識(shí)別和切割位點(diǎn),可能導(dǎo)致脫靶

【解析】

據(jù)圖2可推知,引物1序列應(yīng)包含5′-GCATCCTCCAGG-3′,引物2序列應(yīng)包含5′TAGAGGGACTAC-3′,合成目的基因后需要用限制酶切割,由于目的基因中含有HindⅢ、PstⅠ切點(diǎn),故用于構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)可選擇的酶只剩下BglⅡ、BamHⅠ、EcoRⅠ,為防止自身環(huán)化等情況出現(xiàn),則應(yīng)選擇兩種酶切割,故應(yīng)選擇的酶為BglⅡ、BamHⅠ,最終設(shè)計(jì)的引物應(yīng)在兩端加上特定的酶切位點(diǎn),以便將合成的目的基因完整的切割下來。

1)①過程表示逆轉(zhuǎn)錄過程,催化形成磷酸二酯鍵的酶有逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶,合成的人生長(zhǎng)激素基因中有與終止密碼子相應(yīng)的堿基序列。

2)據(jù)分析可知,引物1序列含GCATCCTCCAGG,引物2序列含TAGAGGGACTAC,在設(shè)計(jì)引物時(shí),應(yīng)在引物15′加上BglⅡ的酶切序列,在引物25′加入BamHⅠ酶切序列,因此引物15′→3′的堿基序列為AGATCTGCATCCTCCAGG,引物2應(yīng)含有限制酶BamHⅠ的識(shí)別序列;從圖1的過程②開始進(jìn)行PCR擴(kuò)增,第六次循環(huán)結(jié)束時(shí),根據(jù)圖示和PCR擴(kuò)增技術(shù)的特點(diǎn),可以推導(dǎo)出共有6個(gè)DNA的序列雙鏈不等長(zhǎng),故圖中可用于構(gòu)建基因表達(dá)載體的DNA片段所占比例是1-6/26=13/16。

3)在構(gòu)建表達(dá)載體的過程中對(duì)圖中質(zhì)粒、DNA片段進(jìn)行合適的完全酶切后,形成的含有2個(gè)酶切位點(diǎn)的片段有3種,向兩者的混合物中加入DNA連接酶,若只考慮DNA切段兩兩連接,則混合物中將形成6種環(huán)狀DNA。

4)①向?qū)?/span>RNA的合成需要RNA聚合酶。Cas9蛋白能切割CCR5基因,故Cas9蛋白是一種限制性核酸內(nèi)切酶。

②將外源基因?qū)胧芫阎袘?yīng)選擇顯微注射法,故“GRISPR/Cas9”技術(shù),是利用顯微注射法將Cas9蛋白和特定的引導(dǎo)序列導(dǎo)入受精卵中發(fā)揮基因編輯作用。

③基因編輯嬰兒引起輿論的關(guān)注,很多科學(xué)家表示反對(duì),原因是細(xì)胞內(nèi)DNA上可能不止一個(gè)Cas9酶識(shí)別和切割位點(diǎn),可能導(dǎo)致脫靶;此外,還存在其他的風(fēng)險(xiǎn)和違背當(dāng)前的倫理道德。

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