Question

【題目】釀酒酵母不能利用木糖制約了利用植物原料生產(chǎn)乙醇的經(jīng)濟(jì)效益。木酮糖激酶是木糖轉(zhuǎn)化、利用的關(guān)鍵 酶，為提高酵母細(xì)胞中木酮糖激酶的表達(dá)量，科研人員將兩種啟動(dòng)子與木酮糖激酶基因結(jié)合并導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞，構(gòu)建 能同時(shí)利用葡萄糖和木糖的重組釀酒酵母。下圖表示相關(guān)研究過(guò)程，表是幾種限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別序列及切割位 點(diǎn)。請(qǐng)回答：

（1）重組質(zhì)粒中終止子的作用是 ____________________。表中切割 DNA 后形成相同黏性末端的限制性?xún)?nèi)切酶是__________________，黏性末端為___________ 。

（2）過(guò)程③使用的限制性?xún)?nèi)切酶是 _________________。過(guò)程⑤需先用 LiAc 處理釀酒酵母細(xì)胞，其目的是 _________________________________ ，使細(xì)胞處于能吸收環(huán)境中DNA的狀態(tài)。

（3）結(jié)合圖示分析，進(jìn)行工程菌篩選時(shí)，在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落不一定是導(dǎo)入重組質(zhì)粒的釀酒酵母，這是因?yàn)?/span> _____________________________________ 。

（4）研究人員對(duì)篩選得到的兩種重組酵母(甲中導(dǎo)入啟動(dòng)子 A，乙中導(dǎo)入啟動(dòng)子 B)細(xì)胞中木酮糖激酶活力及發(fā)酵乙醇得率進(jìn)行比較(發(fā)酵條件：1 L 15 g·L－1 的葡萄糖和 50 g·L－1 的木糖培養(yǎng)基中，120 h)結(jié)果如下表。

重組釀酒酵母	木酮糖激酶酶活力U． mg-2	葡萄糖消耗量g．L-1	木糖消耗量g． L-I	乙醇得率g/g
重組釀酒酵母甲	0． 24	14． 59	48．61	0．34
重組釀酒酵母乙	0． 56	14．98	49．39	0．39

從木酮糖激酶酶活力分析，可以得出的結(jié)論是啟動(dòng)子 A 的功能比啟動(dòng)子B____，但本實(shí)驗(yàn)中乙醇得率相差不大，其可能的原因是____。

Answer 1

【答案】使轉(zhuǎn)錄終止（或使RNA聚合酶與模板分離） XhoⅠ與SalⅠ -AGCT（或TCGA-） EcoRⅠ、BamHⅠ 增大酵母細(xì)胞的通透性 普通質(zhì)粒上有抗四環(huán)素基因，導(dǎo)入普通質(zhì)粒的酵母也能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖 弱 實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（或培養(yǎng)基中的葡萄糖和木糖含量過(guò)少）

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）重組質(zhì)粒中終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄終止；根據(jù)表中6種限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)可知，它們形成的黏性末端依次是-AATT、-GATC、-AGCT、-TCGA、-TA、-TCGA，因此切割DNA后形成相同黏性末端的限制性?xún)?nèi)切酶是XhoⅠ與SalⅠ，黏性末端為-AGCT（或TCGA-）。

（2）過(guò)程①構(gòu)建的重組DNA的兩端含有限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的識(shí)別序列，因此過(guò)程③使用的限制性?xún)?nèi)切酶也是EcoRⅠ、BamHⅠ；過(guò)程⑤需先用LiAc處理釀酒酵母細(xì)胞，其目的是增大酵母細(xì)胞的通透性，使細(xì)胞處于能吸收環(huán)境中DNA的狀態(tài)。

（3）由于普通質(zhì)粒上有抗四環(huán)素基因，導(dǎo)入普通質(zhì)粒的酵母也能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖，因此進(jìn)行工程菌篩選時(shí)，在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落不一定是導(dǎo)入重組質(zhì)粒的釀酒酵母。

（4）甲中導(dǎo)入啟動(dòng)子A，乙中導(dǎo)入啟動(dòng)子B，甲中木糖消耗量小于乙，說(shuō)明啟動(dòng)子A的功能比啟動(dòng)子B弱，但本實(shí)驗(yàn)中乙醇得率相差不大，其可能的原因是實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（或培養(yǎng)基中的葡萄糖和木糖含量過(guò)少）。