Question

【題目】基因打靶技術(shù)是建立在基因同源重組技術(shù)以及胚胎干細胞技術(shù)的基礎上而發(fā)展起來的一種分子生物學技術(shù)。請結(jié)合圖示回答下列有關問題：

注：neor 是新霉素抗性基因；tk 基因的表達可以使無毒的丙氧鳥苷代謝為毒性物質(zhì)，導致細胞死亡。

（1）將目的基因和與細胞內(nèi)靶基因同源的 DNA 片段都重組到__________上，構(gòu)建打靶載體（基因表達載體）。

（2）打靶載體測序驗證正確后，利用__________酶，將之線性化，以提高重組率。通過__________技術(shù)將打靶載體導入胚胎干細胞，這樣打靶載體和與細胞內(nèi)靶基因同源的區(qū)段就有機會發(fā)生同源重組。

（3）為了篩選發(fā)生同源重組的細胞，可在培養(yǎng)液中加入__________。最后還需要通過__________技術(shù)鑒定同源重組的細胞（去除靶基因），將這樣的細胞通過動物細胞培養(yǎng)后，獲得大量打靶成功的細胞。其中， 暫時不用的細胞進行__________保存。

（4）將打靶成功的細胞注射入小鼠囊胚，移植到同種、__________的母鼠體內(nèi)，一段時間后對受體母鼠進行妊娠檢查，確保其生下嵌合體小鼠。這種嵌合體小鼠長大后，體內(nèi)同時存在被“修飾”過的基因和未被“修飾”的基因。如果某些小鼠的__________（填“體細胞”或“生殖細胞”）恰巧被“修飾”過了，則它們的雜交后代中，就可能出現(xiàn)基因完全被“修飾”過的小鼠。

Answer 1

【答案】載體（或質(zhì)粒） 限制 顯微注射 新霉素和丙氧鳥苷 DNA分子雜交 液氮（或冷凍） 生理狀態(tài)相同（或經(jīng)同期發(fā)情處理） 生殖細胞

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)；個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）分析題圖可知，將目的基因和與細胞內(nèi)靶基因同源的DNA片段都重組到載體（或質(zhì)粒）上，構(gòu)建打靶載體（基因表達載體）。

（2）打靶載體測序驗證正確后，利用限制酶，將之線性化，以提高重組率。通過顯微注射技術(shù)導入胚胎干細胞，這樣打靶載體與細胞內(nèi)靶基因同源的區(qū)段就有幾率發(fā)生同源重組。

（3）neor是新霉素抗性基因，tk基因的表達可以使無毒的丙氧鳥苷代謝為毒性物質(zhì)，導致細胞死亡，因此為了篩選發(fā)生同源重組的細胞，可在培養(yǎng)液中加入新霉素和丙氧鳥苷。最后還需要通過DNA分子雜交技術(shù)鑒定同源重組的細胞（去除靶基因），將這樣的細胞通過動物細胞（或克隆）培養(yǎng)后，獲得大量打靶成功的細胞。其中，暫時不用的細胞進行液氮（或冷凍）保存。

（4）將打靶成功的細胞注射入小鼠囊胚，移植到同種、生理狀態(tài)相同（或經(jīng)同期發(fā)情）的母鼠體內(nèi)，一段時間后對受體母鼠進行妊娠檢查，確保其生下嵌合小鼠。這種嵌合體小鼠長大后，體內(nèi)同時存在被“修飾”過的基因和未被“修飾”的基因。如果某些小鼠的生殖細胞恰巧被“修飾”過了，則它們的雜交后代中，就可能出現(xiàn)基因完全被“修飾”過的小鼠。