Question

【題目】科學(xué)家將人的生長激素基因與大腸桿菌的DNA分子進行重組，并成功地在大腸桿菌中得以表達(dá)。但在進行基因工程的操作過程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，便于重組和篩選。已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點是一G↓GATCC一，限制酶Ⅱ的識別序列和切點是一↓GATC—，請據(jù)圖回答：

（1）在構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程中，應(yīng)用限制酶_______切割質(zhì)粒，用限制酶________切割目的基因。用限制酶切割目的基因和載體后形成的黏性末端通過_________原則進行連接。

（2）在過程③中一般將受體大腸桿菌用__________進行處理，以增大___________的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒容易進入受體細(xì)胞。

（3）將得到的大腸桿菌B涂布在一個含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，得到如圖a所示的結(jié)果（圓點表示菌落），該結(jié)果說明能夠生長的大腸桿菌中已導(dǎo)入了__________，反之則沒有導(dǎo)入；再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基a上，使絨布表面沾上菌落，然后將絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖b所示的結(jié)果(圓圈表示與圖a中培養(yǎng)基上對照無菌落的位置）。與圖b圓圈相對應(yīng)的圖a中的菌落表現(xiàn)型是__________，這些大腸桿菌中導(dǎo)入了______________________。

Answer 1

【答案】Ⅰ Ⅱ 堿基互補配對 CaCl2溶液 細(xì)胞壁 普通質(zhì)粒或重組質(zhì)粒 抗氨芐青霉素而不抗四環(huán)素 重組質(zhì)粒

【解析】

已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點是一G↓GATCC一，限制酶Ⅱ的識別序列和切點是一↓GATC—，如果用限制酶Ⅱ切割質(zhì)粒，兩個標(biāo)記基因都被破壞，所以上述質(zhì)粒用限制酶Ⅰ切割；分析題圖可知，要獲取目的基因用限制酶Ⅱ切割。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，還要加入適量的DNA連接酶。質(zhì)粒上至少要有一個標(biāo)記基因的理由是檢測重組質(zhì)粒(或目的基因)是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。

（1）由題意可知，限制酶Ⅰ的識別序列和切點是一G↓GATCC一，限制酶Ⅱ的識別序列和切點是一↓GATC—，因此，限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ能切割的位置限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ也可以切割，限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ和限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ在質(zhì)粒上的切割位點均位于標(biāo)記基因上，為了保證質(zhì)粒上至少保留一個標(biāo)記基因，所以切割質(zhì)粒時需用限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ。目的基因兩端的限制酶識別序列不同，由于限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ能切割的位置限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ也可以切割，所以切割目的基因可用限制性核酸內(nèi)切酶Ⅱ。用限制酶切割目的基因和運載體后形成的黏性末端通過堿基互補配對原則進行連接。

（2）在過程③一般將受體大腸桿菌用CaCl2（Ca2+或鈣離子）處理，以增大細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒容易進入受體細(xì)胞。

（3）由于基因表達(dá)載體上的標(biāo)記基因是抗氨芐青霉素基因，將得到的大腸桿菌B涂布在一個含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，能夠生長的細(xì)菌中都含有抗氨芐青霉素基因，所以，大腸桿菌細(xì)胞中導(dǎo)入的可能是普通質(zhì)粒，也可能是重組質(zhì)粒；再將滅菌絨布按到培養(yǎng)基a上，使絨布表面沾上菌落，然后將絨布按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分析得到的結(jié)果可知，圖中b空圈無菌落形成，說明與之相對應(yīng)的圖a中的菌落應(yīng)該是對四環(huán)素沒有抗性，其表現(xiàn)型是抗氨芐青霉素但不抗四環(huán)素，可以確定這些菌體中導(dǎo)入的一定是重組質(zhì)粒。