Question

【題目】科學(xué)家利用土壤農(nóng)桿菌把編碼霍亂毒素的無毒性β鏈的基因轉(zhuǎn)移到苜蓿細(xì)胞，再將其培養(yǎng)成幼苗。動物食用這種苜蓿苗后，霍亂毒素β鏈很快被喉、腸胃等部位的分泌性粘液細(xì)胞吸收，從而刺激特異性抗體的大量產(chǎn)生，使機(jī)體獲得對霍亂的免疫。其具體過程如下：

⑴從高效表達(dá)霍亂毒素β鏈的生物體中提取mRNA，通過____獲得____用于PCR擴(kuò)增，可得到大量含有霍亂毒素β鏈基因的DNA片段。PCR時(shí)需設(shè)計(jì)一對與霍亂毒素β鏈基因兩端序列互補(bǔ)配對的引物（引物1和引物2），為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當(dāng)?shù)?/span>____位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間____而造成引物自連。

⑵將目的基因插入到土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的____上，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化，目的基因就能整合到苜蓿細(xì)胞的染色體DNA上，構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是____。

⑶Ti質(zhì)粒上有一個(gè)tms片段能促進(jìn)生長素的大量合成，在對Ti質(zhì)粒改造時(shí)應(yīng)____，以防苜蓿體內(nèi)生長素濃度過高而抑制苜蓿生長。

⑷欲檢測苜蓿細(xì)胞內(nèi)是否具有霍亂毒素β鏈，在分子水平上檢測的方法是從轉(zhuǎn)基因的苜蓿細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行____。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄 cDNA 限制性核酸內(nèi)切酶酶切 堿基互補(bǔ)配對 T-DNA 使目的基因在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地復(fù)制并表達(dá) 將該片段去除 抗原﹣抗體雜交

【解析】

本題以“圖文結(jié)合”為情境，考查學(xué)生對基因工程的基本操作程序等相關(guān)知識的識記和理解能力，以及識圖分析能力。

(1) 采用逆轉(zhuǎn)錄法獲取霍亂毒素β鏈基因（目的基因）并利用PCR技術(shù)對其進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，首先從高效表達(dá)霍亂毒素β鏈的生物體中提取mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，其次是將cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)需要設(shè)計(jì)一對與霍亂毒素β鏈基因兩端序列互補(bǔ)配對的引物。因霍亂毒素β鏈基因兩端插入了引物，因此在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，要在引物中增加適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，以保證目的基因（霍亂毒素β鏈基因）完整地插入到重組質(zhì)粒中。設(shè)計(jì)引物時(shí)，需要避免引物之間堿基互補(bǔ)配對，否則會造成引物自連，導(dǎo)致目的基因無法插入到重組質(zhì)粒中。

(2) 利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)�入苜蓿�?xì)胞的原生質(zhì)體中，需將目的基因插入到土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA上。構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的是使目的基因在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。

(3) 由于Ti質(zhì)粒上有一個(gè)tms片段能促進(jìn)生長素的大量合成，而生長素濃度過高會抑制苜蓿生長，所以在對Ti質(zhì)粒改造時(shí)應(yīng)將該片段去除，以防止苜蓿體內(nèi)生長素濃度過高而抑制苜蓿生長。

(4) 欲檢測苜蓿細(xì)胞內(nèi)是否具有霍亂毒素β鏈，即“檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)”，在分子水平上應(yīng)采用抗原﹣抗體雜交技術(shù)從轉(zhuǎn)基因的苜蓿細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行檢測。